[發明專利]一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株及其篩選方法

無效

• 申請號: 201310398796.6
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103509742A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 高兆建;張桂英;陳宏偉;孫會剛;張從省;王東星
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓然

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技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，特別是涉及一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株及其篩選方法。

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背景技術

彈性蛋白酶（elastase）是一種以水解不溶性彈性蛋白質為主的廣譜蛋白水解酶，它主要從動物胰臟中分離獲得。該酶在微生物類群中也廣有分布，如細菌、放線菌、真菌中都可分泌胞外蛋白酶。自Mandl?和Cohen?首次分離到了產彈性蛋白酶的微生物Flavobacterivm?elastolyticium?以來，相繼發現假單孢菌屬(Pseudomonas)、弧菌屬(Vibrio)?、鏈球菌屬(Staphylococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)?、芽孢桿菌屬都有產酶的能力。在食品工業，因其在不同種類蛋白質存在的情況下，對不溶性的彈性蛋白具有較高的水解活性，故在肉類加工中，彈性蛋白酶可以用于肉的嫩化處理，使肉類的品質變得柔軟、多汁和易于咀嚼，并可縮短肉的烹調時間、改善肉的風味、增加其營養價值。在生物防治中，彈性蛋白酶能降解昆蟲堅硬的表皮結構蛋白，再侵入昆蟲體內。在醫藥領域，彈性蛋白酶主要作為治療高血脂癥、防止動脈粥樣硬化的生化藥物。目前我國生產彈性蛋白酶產品的方法是從豬胰臟提取，但臟器資源不足，限制了彈性蛋白酶的應用，由于微生物彈性蛋白酶與豬胰臟彈性蛋白酶一樣,?具有廣泛的水解活性,?不但能降解彈性硬蛋白，而且對明膠、血纖維蛋白、血紅蛋白、白蛋白等多種蛋白質都有降解作用,?是一種廣譜的肽鏈內切酶。但現有公知的用于產酶菌株的方法還存在不易培養、生產安全性不高和遺傳穩定性差等不足。如何克服現有技術的不足已成為當今生物工程技術領域中亟待解決的重點難題之一。

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發明內容

本發明的目的是為克服現有技術的不足而提供一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株及其篩選方法，本發明的產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株容易培養，生產安全性高，遺傳穩定性好，其代謝產物彈性蛋白酶容易分離純化，且其代謝產物彈性蛋白酶的酶活較高。

根據本發明提出的一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株，其特征在于所述菌株ELAT4的分類命名為地衣芽孢桿菌(Baclicus?lincheniformis)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2012年2月10日，保藏號為：CGMCC?No.?5700；

所述菌株ELAT4（CGMCC?No.?5700）具有以下特性：

(1)菌落形態：菌落呈灰白色，較粘稠、易挑起，表面濕潤；

(2)菌體形態：菌體產耐熱芽孢，孢囊不膨大，革蘭氏染色陽性，顯微鏡下呈單個菌體，直桿狀，兩端鈍圓，芽孢橢圓中生；

(3)生長條件：最低溫度18℃，最高溫度55℃，最適生長溫度34～37℃；

(4)生理生化特征：V.P試驗陽性，吲哚試驗陰性，甲基紅試驗陽性，硝酸鹽還原陽性，過氧化氫酶試驗陽性，明膠液化陽性，淀粉水解陽性，酪素水解陽性。

經16S?rDNA?序列比對以及系統發育分析：本發明的菌株ELAT4的16S?rDNA經克隆測序，核苷酸序列大小為1421bp，利用ClustalX1.8軟件采用Neighbour-joining方法構建系統發育樹，菌株ELAT4的16S?rDNA核苷酸序列與Bacillus?licheniformis（EF173323）的16S?rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(max?ident)達到99%；綜合ELAT4菌株的形態學特征、生理生化特征及16S?rDNA核苷酸序列同源性分析結果，將菌株ELAT4鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)。

根據本發明提出的一種用于產彈性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株的篩選方法，其特征在于依次包括如下具體步驟：

步驟一，土樣采樣：土樣取自牛羊屠宰場的受污染物；