[發(fā)明專利]一種斑馬魚體內(nèi)ROS檢測模型的建立方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310398791.3
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103430890B
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 勞喬聰;李春啟;朱鳳;俞航萍
• 申請（專利權(quán)）人: 南京新環(huán)檢測科技有限公司
• 主分類號: A01K61/00
• 分類號: A01K61/00;A61K49/00;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種斑馬魚體內(nèi)ROS檢測模型的建立方法，同時提供一種利用該模型篩選抗氧化藥物的方法。模型的構(gòu)建方法主要包括：斑馬魚的發(fā)育階段的確定，檢測用斑馬魚數(shù)量的確定，陽性對照化合物GSH的濃度確定微孔板分析,統(tǒng)計學(xué)分析幾個步驟。應(yīng)用斑馬魚體內(nèi)ROS檢測模型進(jìn)行抗氧化藥物的篩選具有可靠、快速、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)高通量篩選抗氧化藥物。本發(fā)明對抗氧化藥物的開發(fā)有著重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種藥物篩選模型，具體的說，涉及一種簡單、快速和高效的抗氧化藥物篩選的斑馬魚體內(nèi)ROS檢測模型的建立方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)是生物體內(nèi)影響信號傳導(dǎo)的重要物質(zhì)，包括：O^2-·、H₂O₂ 及HO₂·、·OH 等，與許多衰老相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展預(yù)防和治療相關(guān)，如心血管疾病、老年癡呆、腫瘤、糖尿病等。大量人群和實(shí)驗(yàn)研究表明，采用有效的預(yù)防手段，特別是合理服用抗氧化劑或自由基清除劑，均可有效控制這些疾病的發(fā)生，發(fā)揮良好的預(yù)防作用^[1]。

目前，抗氧化藥物篩選模型常為分子與細(xì)胞水平的篩選模型，這些體外抗氧化藥物篩選模型，都不涉及藥物在生物體內(nèi)的吸收分布代謝情況，所以都不能準(zhǔn)確地預(yù)測藥物的體內(nèi)抗氧化能力^[2-3]。此外，一些體內(nèi)的抗氧化篩選模型，由于檢測方法復(fù)雜，檢測指標(biāo)較多，實(shí)驗(yàn)費(fèi)用高等不利因素，未能廣泛應(yīng)用于抗氧化藥物的篩選^[4-5]。所以，開發(fā)一種簡單、快速的體內(nèi)抗氧化藥物篩選模型意義重大。

斑馬魚是一種新穎的模式生物。與傳統(tǒng)的體內(nèi)和體外篩選模型相比較，活體斑馬魚篩選模型具有諸多優(yōu)勢，克服了原有體外模型在吸收、分布、代謝和排泄環(huán)節(jié)驗(yàn)證的欠缺及傳統(tǒng)體內(nèi)篩選模型實(shí)驗(yàn)周期長、操作復(fù)雜、成本高的弊端。斑馬魚是一種脊椎動物，與人類基因的相似度高達(dá)85%左右，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)。與鼠類等哺乳動物相比，斑馬魚胚胎透明，可同時觀察分析多個器官，實(shí)驗(yàn)周期短，樣本容量大，結(jié)果可信度高，所需費(fèi)用低^[6]。更重要的是，斑馬魚模型具有與生俱來的優(yōu)點(diǎn)^[6-7]：①飼養(yǎng)成本低，性成熟周期短；②繁殖能力強(qiáng)，一尾雌魚每次可產(chǎn)200～300枚卵；③生長發(fā)育速度快，在受精24h后，斑馬魚主要的組織器官原基已形成，可為研究提供大量的樣本和較短的實(shí)驗(yàn)周期；④胚胎及幼魚透明，體外受精，體外發(fā)育，可直接觀察，并可同時分析多個器官系統(tǒng)；⑤胚胎有可以提供營養(yǎng)的卵黃，第一周內(nèi)不需喂食，可避免化合物處理時化合物與食物成份的相互作用；⑥胚胎體積小，幼魚體長只有1-4 mm，能夠在一個標(biāo)準(zhǔn)的6、12、24、48或96孔板內(nèi)進(jìn)行分析；⑦給藥方式簡單：溶于水的小分子物質(zhì)可直接經(jīng)皮膚、鰓及消化系統(tǒng)進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)；不溶于水的物質(zhì)、大分子物質(zhì)及蛋白質(zhì)可進(jìn)行顯微注射。因此斑馬魚可作為很好的疾病模型研究材料。

5-(and-6)-carboxy-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate（carboxy-H₂DCFDA）是一種常用的ROS特異性熒光檢測試劑，無熒光carboxy-H₂DCFDA通過與斑馬魚體內(nèi)的ROS反應(yīng)，生成熒光活性的2′,7′-dichlorofluorescein（DCF）；使用酶標(biāo)儀定量檢測DCF的熒光信號，從而相對定量測定生物體內(nèi)ROS的量^[8]。

本發(fā)明提供的斑馬魚ROS檢測模型有利于簡單、高效、快速篩選抗氧化藥物，對抗衰老和預(yù)防衰老相關(guān)疾病有著重要意義。與以往的模型相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1）活體內(nèi)—實(shí)驗(yàn)材料為活體斑馬魚，作為一種脊椎動物，其篩選模型屬體內(nèi)模型，能夠真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性。