[發明專利]一種新的耳聾相關基因突變檢測體系及試劑盒

在審

• 申請號: 201310397956.5
• 申請日: 2013-09-04
• 公開（公告）號: CN104419757A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 馮永;劉德遠;梅凌云;賀楚勝;劉亞蘭;蔣璐;陳紅勝;余鋒
• 申請（專利權）人: 中南大學湘雅醫院;天昊生物醫藥科技（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 劉懿

技術領域

本發明涉及遺傳性耳聾分子檢測領域的一種基因突變檢測體系，具體而言，涉及一種新的耳聾相關基因突變檢測體系及試劑盒。

背景技術

耳聾是一種常見的臨床疾病，主要與遺傳因素及環境因素密切相關，即可能是由相關基因突變引起，也可能是由環境暴露、創傷、藥物等引起。據報道對于新生兒的先天性耳聾50%是遺傳因素導致，在相關報道的先天性病例中，有約70%屬于非綜合征性耳聾。此類病例又可分為常染色體顯性、常染色體隱性、性連鎖和線粒體遺傳性耳聾四類，已有報道的耳聾相關位點114多個。

目前針對遺傳性耳聾檢測診斷方法，較普遍使用是檢測病人耳聾相關的基因是否存在缺陷，涉及到DNA檢測的相關技術應用。常用的檢測技術包括：限制酶切指紋-單鏈構象多態性分析、限制性片段長度多態性分析、變性高效液相色譜分析、基因芯片、飛行時間質譜、外顯子捕獲技術、直接測序等技術，以上各種檢測技術各存優缺點。

限制酶切指紋-單鏈構象多態性分析是用限制性核酸內切酶切割目標基因的PCR擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測梅切產物，根據異常構象帶進行目標基因有無突變的判斷。該方法最主要的問題是不能檢測到所有的突變，由各實驗室報道的突變檢出率沖99%到35%不等。同時該方法要求多次摸索條件，如電泳溫度，膠中甘油濃度以及膠聯度等均可影響檢測的靈敏度。此外，該方法也不能確定突變的精確位置。

限制性片段長度多態性是用特定的限制性內切酶水解目標基因的PCR擴增產物，然后分析酶解產物的電泳圖譜特征，根據與正常對照的比對結果來判斷待檢樣品是否存在某個基因突變，其弱點操作繁瑣，檢出率低，因為并非所有的基因突變都恰好位于某個內切酶的識別區。

變性高效液相色譜分析此技術是一項在單鏈構象多態性分析和變性梯度凝膠電泳基礎上發展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術。它能對大批量PCR擴增產物進行篩查，其在檢測大量致病基因的不同序列方面顯示出高度的敏感性，適合做快速的基因篩查。但它也有一些不盡如人意之處：（1）它只是提供了定性的信息，而無法得出具體的突變類型和突變位點。尚需測序等后續方法證實；（2）其結果判斷通常是由操作者進行的，容易產生觀察差異，不利于各實驗室之間的靈敏度比較；（3）許多片段有多個主要解鏈溫度，需要篩查的溫度較多，增加的工作量。目前該技術主要用來檢測200～300bp大小的DNA片段，長的DNA片段的檢測尚未見報道。

基因芯片因其具有微型化、集約化、標準化和高通量的特點，在感染性疾病、遺傳性疾病、重癥傳染病和惡性腫瘤等疾病的臨床診斷方面具有獨特的優勢，可將對應于突變熱點的寡核苷酸探針合成點或點加于DNA芯片上，通過一次雜交完成對待測樣品多種突變可能性的篩查，實現對疾病的高效快速診斷，但芯片檢測平臺售價高昂，不利臨床推廣；現有的臨床耳聾基因檢測芯片只檢測9個突變位點，突變檢出率較低。

飛行時間質譜方法檢測基因是首先進行PCR擴增目的片斷區域，然后加入多對特異性引物，進行單堿基延伸，再將單堿基延伸產物純化后質譜分析，根據不同引物擴增產物的質荷比不同，判斷有無堿基突變。目前，深圳華大基因研究院通過飛行時間質譜和外顯子捕獲兩種檢測方法檢測耳聾基因。外顯子捕獲技術目前可以檢測非綜合征型耳聾的51個基因和2個突變位點，和其他比較常見的綜合征型耳聾，例如Alport綜合征、Waardenburg綜合征等。飛行時間質譜檢測技術目前主要檢測中國人群中高發的20個突變位點，準確度高但檢測費用較高，所用時間較長。

直接測序是將聚合酶鏈式反應擴增產物純化、變性后，在測序儀上進行測序，為尋找突變的金標準。但其儀器設備昂貴，且操作復雜、耗時較長。此外，雜合突變、膠壓縮、GC富集區的存在等問題使得很難通過一次測序獲得精確的數據。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的以上問題，提供一種新的耳聾相關基因突變檢測體系及試劑盒，篩選出32個耳聾相關基因檢測位點，包括一個國際上未報道過的新發位點，并且結合PCR等技術組合成一個高效準確快速的檢測體系，實現在該體系內對32個耳聾基因突變位點的同時快速檢測，可應用于生物學研究和遺傳性耳聾分子檢測領域。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：