[發明專利]一個花椰菜器官發育調控基因編碼序列及其應用

有效

• 申請號: 201310397370.9
• 申請日: 2013-09-05
• 公開（公告）號: CN103451190A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 王春國;李慧;陳成彬;宋文芹
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

1.?一個在花椰菜器官發育中發揮關鍵調控作用的基因編碼序列，它由序列5’?ATGATTCGTGAAATCTCCGGTCTACAAAACGACATCGTAAACATTCAAGAACGCTCTTCAAGCAGCAACAACAAGATCATGGACATGAGAAGAGATATTCGCCGACCAGCTCAAGCTCCTATGATGAGTAAGCAAGAATATTTTCGGACATTGTCGTCTCAGAACAGTCCGAGGAGGCTAATCTCAGCGAGTCACTTCAGTTTGGAGTCAATGGTTGTTCTTGTTGGTCTCACAGCATCGCTCTTGATCCTTCCCTTGATTCTTCCACCGTTGCCTCCTCCTCCGTTCATGCTGCTTCTCATTCCTATTGGGATAATGGTTCTGCTTATGGTTCTTGCTTTAATGCCTTCTTCTTCCTCTTCTTCTTCTTCTTCTAATGCCTTACATGTAACAAGAACTTATATGTAA3’組成。

2.一種利用權利要求1所述基因編碼序列培養高生物量轉基因植物的方法，其特征在于它按如下的步驟進行：

（1）花椰菜總RNA提取及第一鏈cDNA合成；

（2）帶酶切位點引物設計、合成：利用生物學軟件設計帶XbaI和SacI酶切位點的引物：ARL-S:5’?TCTAGAATGATTCGTGAAATCTCCG3’(下劃線表示XbaI酶切位點)；ARL-A:5’?GAGCTCTTACATATAAGTTCTTGTTACATGT3’（下劃線表示SacI酶切位點），引物序列由上海生物工程公司合成；

（3）過表達轉化載體構建：用SDS堿裂解法分別提取pBI121質粒和含有上述基因編碼序列的質粒；將上述基因編碼序列的質粒和pBI121載體質粒同時采用XbaI和SacI雙酶切，酶切體系如下：質粒1μg、10×T?buffer?2μL、0.1%BSA?2μL、15U/μL?的XbaI?0.5μL、10U/μL的?SacI?0.5μL，無菌水補至20μL，將上述混合液置于0.2mL的離心管中，37度孵育3h；將帶有相同酶切位點目的基因片段及pBI121質粒的回收并進行連接，連接體系如下：pBI121質粒4μL、目的片段4.5μL、10×ligase?buffer?1μL、Ligase?0.5μL、無菌水補至10μL，將上述連接混合物置于0.2mL的離心管中輕輕混勻后，16℃?水浴保溫16?h；重組質粒的轉化：加5μL連接產物于50μL大腸桿菌感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30?min；42℃熱激30?s，立即置于冰上2?min；加500μL平衡至室溫的LB培養基，180rpm?37℃孵育1h；4000rpm離心1min后，棄掉部分上清，剩余150?μL重懸菌體，涂于含100?mg/L?Kan?LB固體培養基平板；37℃培養過夜；挑取白色克隆于1mL含100?mg/L?Kan?LB培養基中，37℃，180rpm?培養8?h，取1μL菌液作為模板進行PCR鑒定，篩選獲得陽性重組質粒；重組質粒轉化農桿菌LBA4404：取1μg重組質粒加入100?μL農桿菌感受態中，輕輕混勻；冰浴?30?min；液氮速凍5?min；37℃熱擊?5?min；加入800?μL不含抗生素的YEB液體培養基，28℃?180?rpm?復蘇4?h；4000?rpm離心1min后，棄掉部分上清，剩余150?μL重懸菌體，涂于YEB培養基平板；28℃倒置培養2-3?d；挑取白色克隆于1?mL含50mg/L?Rif、100mg/L?Str和100?mg/L?Kan?的YEB培養基，28℃，220?rpm?培養1~2d，取1μL菌液作為模板進行PCR鑒定；同時提取農桿菌陽性質粒進行雙酶切鑒定，取經鑒定的陽性菌株菌液500μL加入500μL?40%?甘油YEB培養基，正當混勻后于-20℃保存備用；

（4）遺傳轉化：將-20℃保存的含有目的基因重組質粒的農桿菌菌液接種于10?mL?YEB液體培養基中，28℃，220?rpm?活化1~2?d；按1：100比例取2.5?mL菌液接種于250mL?YEB液體培養基中，28℃?220?rpm過夜?培養至OD₆₀₀?為1.2~1.6；5,000?rpm?離心10?min?收集菌體，將菌體重懸于500?mL?5%蔗糖溶液中，加入100?μL終濃度為0.05%?的silwet?L-77，混勻后轉入轉化杯中作為轉化液待用；待轉化的擬南芥前一天澆透水，去掉已結莢，將擬南芥倒置于轉化杯中，輕輕搖動轉化液，浸染15s后將植株移出，抖去多余轉化液，用保鮮膜包好，側置于托盤中?，避光1d，然后直立培養，5d?后按照同樣方式進行第二次轉化；

（5）轉基因陽性苗篩選：將種子均勻播種于含50?mg/L?Kan?的MS固體培養基中，吸去多余水分；4℃?黑暗條件下春化3-4d后置于22℃，16h光照，8h黑暗光照培養箱中培養；7-14?d?后轉基因陽性苗子葉濃綠并且根系發達，非轉基因苗則只有兩片子葉，最后逐漸白化死亡；待陽性苗長至4葉期后轉至營養土中，一盆一苗，人工培養室培養，覆膜2d后揭膜繼續培養；

（6）轉基因植物生物學性狀觀察，對純化后的轉基因植株進行生物學性狀觀察。