[發(fā)明專利]一種干酪乳桿菌中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分布規(guī)律的快速定性檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310395515.1
• 申請日: 2013-09-04
• 公開（公告）號: CN103421910A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張文羿;張和平
• 申請（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/48
• 代理公司: 北京君智知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 向華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是干酪乳桿菌中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分布規(guī)律的快速定性檢測。本發(fā)明的檢測方法運用基于聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase?chainreaction,PCR）技術(shù)對干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分布規(guī)律進行快速、定性檢測，檢測工作可在一個工作日內(nèi)完成。?

背景技術(shù)

谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GlutathioneS-transferases,GSTs）是一個古老而功能分化較快的蛋白家族，主要存在于真菌、藻類、原生動物基因組中，其同功酶可以催化谷胱甘肽(GSH)與親電物質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，可以降解致癌物質(zhì)、環(huán)境污染物、植物除草劑中含有的一系列廣譜異源物質(zhì)。該酶在植物中被證明參與對氧化脅迫的抵抗；在原核生物中也發(fā)現(xiàn)編碼有GST的同源基因，如：根際微生物和各種腸細菌中，但其具體功能還不明確。一些研究者發(fā)現(xiàn)該酶具有過氧化物活性，可以在龍膽酸鹽、二氯甲、木質(zhì)素的分解代謝反映中扮演催化劑的角色。?

之于GST的功能，Bartels等通在實驗過程中發(fā)現(xiàn)在含有聯(lián)苯的培養(yǎng)基中，GST具有較高的活性。此外一些研究證據(jù)也表明GST蛋白家族的成員可以在有氧條件下降解不同種類的芳香類物質(zhì)，GST活性并不是聯(lián)苯代謝過程中的必需酶，但可以賦予宿主相關(guān)的代謝功能。人體腸道內(nèi)存在著大量的大腸桿菌，變形桿菌等，它們在生長繁殖的過程中不斷的積累、釋放內(nèi)毒素。新近關(guān)于基因組分析的文章顯示，干酪乳桿菌中可鑒定出GST基因，該基因與博克霍爾德氏菌LB400的BphK具有37%的相似性，該基因編碼的蛋白的C端和N端，分別含有一個與GST關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)域(PF02798，PF00043)。但干酪乳桿菌中是否普遍存在GST基因，該基因在干酪乳桿菌群中的分布情況還有待進一步研究和確認。明確GST基因在干酪乳桿菌群中的分布情況，對于進一步研究該基因的功能具有重要意義。?

本發(fā)明針對干酪乳桿菌群中編碼的谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶，依據(jù)參考文獻自行設(shè)計?了一種基于PCR技術(shù)的快速、定性檢測方法，通過對電泳圖譜的分析來確定干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的分布規(guī)律。這一方法的建立無疑將有助于理解和研究干酪乳桿菌中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的功能，進而為我國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌未知代謝途徑的研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerasechainreaction,PCR）技術(shù)，通過對干酪乳桿菌谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶核心序列區(qū)域的擴增和對凝膠電泳圖譜的分析來確定谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的有無，從而完成對干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分布規(guī)律的檢測。?

本發(fā)明的干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的快速定性檢測方法的具體操作步驟包括：從干酪乳桿菌中提取DNA，應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶基因的核心區(qū)域，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，通過對干酪乳桿菌谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶核心區(qū)域的擴增和凝膠電泳圖譜的分析來確定該基因的有無，對干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分布規(guī)律進行定性檢測，其中PCR擴增所采用的引物對為F：5’-TACGATCAAATCAACGCCA-3’；R：5’-CGCAGAACTTCCTGCACAC-3’。?

所述方法的具體操作步驟如下：?

a.提取干酪乳桿菌DNA?

細菌培養(yǎng)液5ml，10,000rpm離心1分鐘，棄上清；加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37℃處理30-60分鐘；加入20μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，混勻；加220μl緩沖溶液GB，振蕩15秒；70℃放置30分鐘；加入220μl無水乙醇，充分振蕩15秒；將溶液加入吸附柱中，12,000rpm離心30秒；加500μl去蛋白液GD，12,000rpm離心30秒，棄廢液；加700μl漂洗液GW，12,000rpm離心30秒，棄廢液；加500μl漂洗液GW，12,000rpm離心30秒，棄掉廢液；再次12,000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12,000rpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌基因組DNA；?

b.擴增谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶核心區(qū)域?

擴增體系如下：?