[發(fā)明專(zhuān)利]一種干酪乳桿菌中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分布規(guī)律的快速定性檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310395515.1
• 申請(qǐng)日: 2013-09-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103421910A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張文羿;張和平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/48
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 向華

1.一種干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的快速定性檢測(cè)方法，其特征在于具體操作步驟包括：

從干酪乳桿菌中提取DNA，

應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶基因的核心區(qū)域，

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，通過(guò)對(duì)干酪乳桿菌谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶核心區(qū)域的擴(kuò)增和凝膠電泳圖譜的分析來(lái)確定該基因的有無(wú)，對(duì)干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分布規(guī)律進(jìn)行定性檢測(cè)，其中PCR擴(kuò)增所采用的引物對(duì)為F：5’-TACGATCAAATCAACGCCA-3’；R：5’-CGCAGAACTTCCTGCACAC-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌群中谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶的快速檢測(cè)方法，其特征在于具體操作步驟如下：

a.提取干酪乳桿菌DNA

細(xì)菌培養(yǎng)液5ml，10,000rpm離心1分鐘棄上清，棄上清棄上清；加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37℃處理30-60分鐘；加入20μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液，混勻；加220μl緩沖溶液GB，振蕩15秒；70℃放置30分鐘；加入220μl無(wú)水乙醇，充分振蕩15秒；將溶液加入吸附柱中，12,000rpm離心30秒；加500μl去蛋白液GD，12,000rpm離心30秒，棄廢液；加700μl漂洗液GW，12,000rpm離心30秒，棄廢液；加500μl漂洗液GW，12,000rpm離心30秒，棄掉廢液；再次12,000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12,000rpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌基因組DNA；

b.擴(kuò)增谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶核心區(qū)域

擴(kuò)增體系如下：

PCR擴(kuò)增體系：0.2μlTaq聚合酶,2.5μl10×PCR緩沖液,2.5mM的dNTP各2μl,25mM的MgCl₂2μl,1μl上游引物,1μl下游引物,1μl基因組DNA和10.3μlddH₂O；

PCR擴(kuò)增條件：94℃變性5min；94℃30s，56.5℃30s，72℃40s，如此進(jìn)行45次循環(huán)；72℃延伸10min，4℃30min；

c.瓊脂糖凝膠電泳

將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20-30min，EB染色，紫外拍照，檢測(cè)擴(kuò)增效果，通過(guò)與對(duì)照菌株條帶對(duì)比得出結(jié)果。