[發明專利]人免疫缺陷病毒-1NASBA-ELISA檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201310394793.5
• 申請日: 2013-09-04
• 公開（公告）號: CN103540684A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 尹銳;薛健;王艷芳;孫亞娟
• 申請（專利權）人: 薛健;尹銳
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域中的NASBA(Nucleic?Acid?Sequence-based?Amplification，依賴核酸序列擴增)試劑盒，尤其涉及人免疫缺陷病毒-1?NASBA-ELISA?檢測試劑盒。?

背景技術

獲得性免疫缺陷綜合癥是由人免疫陷病毒（HIV）引起的一種嚴重危害人類健康的致死性傳染病。根據病毒核酸測序將HIV分為HIV-1和HIV-2兩型，其中HIV-1是目前全球流行主要毒株，具有很強變異性，分子流行病學調查結果顯示，我國已經成為HIV-1流行最多的國家之一。目前國際上建立了一系列用于檢測HIV病原體的方法，其中最常應用檢測HIV-1的方法是抗體檢測，但從人體感染HIV到血液出現HIV特異性抗體有一個約為1～3個月“窗口期”，該時期內病人無法確認自己是否感染，故無法對HIV-1實現早期診斷。對病原體進行核酸檢測可以縮短檢測的窗口期做到早期診斷,常用的核酸檢測方法主要有real?time?RT-PCR?、RT-PCR等。但real?time?RT-PCR因需要昂貴的熒光定量PCR儀而限制了其在發展中國家廣泛推廣；而普通RT-PCR雖對設備要求較低，但較容易出現假陽性結果，不能很好地滿足臨床需要。?

核酸序列依賴性擴增(nucleic?acid?sequence-based?amplification，NASBA)是一項成熟的恒溫RNA擴增技術，現已廣泛應用于肝炎病毒、狂犬病病毒、禽流感病毒等病原體的快速檢測。其中檢測禽流感病毒的NASBA方法已被列為國家診斷標準方法之一。本發明在NASBA擴增HIV-1?RNA的基礎上結合寡核苷酸液相分子雜交和酶標顯色反應，建立了用于檢測HIV-1型病毒的NASBA-ELISA方法。?

發明內容

本發明的目的就在于克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種HIV-1?NASBA-ELISA檢測試劑盒。?

本發明的目的是這樣實現的：?

1、HIV-1?NASBA-ELISA檢測試劑盒

本試劑盒是在對HIV-1序列分析的基礎上，選取保守基因序列設計出

一對特異性引物和一條特異性探針，利用NASBA技術對HIV-1進行檢測。此技術僅需要常規的酶標儀和水浴鍋便能完成對臨床樣本的檢驗，能夠將分子診斷技術在基層醫療機構推廣，具有潛在的應用價值。

具體的說，本試劑盒包括HIV-1的一對特異性引物、一條特異性熒光探針、陽性對照、陰性對照、NASBA?Buffer?、Enzyme?Mix、NASBA?產物檢測試劑。?

①HIV-1基因的一對特異性引物?

F:5’-TGATGCAAGGTCGATATGAGCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’，?下劃線部分與檢測探針互補；R:?5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGG

GGGCGCCACTGCTAGAGA-3’，下劃線部分為T7啟動子序列。

②HIV-1基因的探針?

捕獲探針：5’-Biotin-TCTGGTAACTAGAGATCCCTC-3’，為基因特異探針。檢測探針：5’-DIG-TGATGCAAGGTCGATATGAG-3’。

③陽性對照?

人免疫缺陷病毒-1型的患者血清；

④陰性對照

不含人免疫缺陷病毒-1型的正常人血清?；

⑤NASBA?擴增試劑：

擴增緩沖液：40?mmol/I，pH8.5?Tris-HC1，120?mmol/L?KCl，10?mmol/L?MgC1，5?mmol/L?DTT，1?mmol/L?dNTP，10?mmol/L?NTP，100?g/L?DMSO。

酶混合液：含40U?SupeScript?II反轉錄酶、80U?T7?RNA聚合酶、0.2U?核糖核酸酶H?

⑥NASBA?產物檢測試劑

96?孔酶標板：鏈酶親和素包被的酶標板

雜交緩沖液：20×SSPE（?pH7.4），50mM/L?Tris-HCl?(?pH8.8)，1﹪?（W/V）BSA?43μl

酶標抗體：堿性磷酸酶抗地高辛抗體?100μl

洗液：PBST?溶液（含0.05%Tween-20，pH7.2，PBS）?450μl。

顯色液：3mg?pNPP?溶于1mLddH2O?中,?加入1mL二乙醇胺，避光-20℃保存?，100μl?