[發明專利]一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法與應用

有效

• 申請號: 201310394101.7
• 申請日: 2013-09-03
• 公開（公告）號: CN103487590A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 李守軍;李華濤
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/80
• 分類號: G01N33/80
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

技術領域

??本發明屬于血型鑒定技術領域，具體涉及一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法與應用。

背景技術

血型鑒定在輸血治療中非常重要，并且每天都在發生在全世界。試劑紅細胞包括ABO反定型用的試劑紅細胞、各種紅細胞譜細胞（Panel?cell?RBC）及特殊或稀有血型紅細胞，用于血型鑒定、紅細胞血型抗體研究和檢查紅細胞抗體等方面，這些紅細胞血型抗原十分寶貴，也是難得的必備工作試劑。所有的血型血清學實驗室都是必須常規配備的。目前，絕大多數血型血清學實驗室使用的試劑紅細胞，主要是全血經生理鹽水多次洗滌，再添加一定量的紅細胞保存液后而制成。目前反定型檢測使用試劑紅細胞，由于其易溶血、保存期短等原因，試劑質量難以保證，由此導致ＡＢＯ血型反定型檢測至今未達到規范化、標準化。

現在技術中所建立的紅細胞抗體檢測方法有試管法，紙片法，微柱凝膠檢測卡法等，常規的這些方法都避免不了用到試劑紅細胞。

斑點酶聯免疫吸附測定法(Dot-ELISA)是以纖維素膜代替免疫酶固相載體法中常用的聚苯乙烯微量反應板而建立的一種免疫檢驗方法。Dot-ELISA不僅保留了常規ELISA的優點，而且還彌補了抗原或抗體對載體包被不牢等不足，所以具有敏感性高，特異性強，被檢樣品用量少，節省材料，不需特殊儀器，結果判定簡單易行和便于長期保存等特點。?

Dot-ELISA的基本原理與常規ELISA和免疫酶染色法基本相同，即將抗原或抗體首先吸附在纖維素薄膜(如硝酸纖維素膜，NC)表面，并保持其免疫活性，通過與相應的抗體或抗原和酶標記物的一系列免疫反應，形成酶標記抗原抗體復合物，在底物的參與下，結合物上的酶催化底物使其水解、氧化成另一種帶色物質，沉著于抗原抗體復合物吸附的部位，呈現出肉眼可見的顏色斑點。試驗的結果可通過顏色斑點的出現與否和色澤深度進行判定。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法。

本發明的另一個目的是提供一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法的應用。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

????一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法，包括如下步驟：

S1.將硝酸纖維素膜固定于96孔板底部得Dot-ELISA?96孔板；

S2.取1～5μL紅細胞膜點在S1所述?96孔板孔內的硝酸纖維素膜上，26～37℃干燥10～30min，用100～250μL?3%的脫脂乳封閉96孔板15～45min；

S3.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL待檢血清溶液，26～37℃反應30～60min；

S4.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL酶標二抗溶液，?37℃反應30～45min；洗板、拍干后向孔中加入80～150μL底物顯色溶液，顯色5～10min，終止反應，記錄結果。

優選地，Dot-ELISA?96孔板的制備方法為：將硝酸纖維素膜用蒸餾水侵泡，制合適大小的圓形膜，干燥后放入96孔板中，用固定環壓緊硝酸纖維素膜于96孔板底部，放入干燥箱中干燥1～2h即的；

所述固定環為塑料材料制成，固定環為高度為2～4mm，厚度為0.04～0.08mm的圓柱形環。環外徑與所用的96孔板孔的內徑配套，固定環兩端外徑分大小端，大端外徑稍大于或等于96孔板內孔徑，使固定環能與96孔板孔貼緊，不易滑脫，小端外徑稍小于96孔板孔內徑，使固定時容易壓進96孔板孔內。市場上常用的96孔板孔內徑大小為6.8mm，對于這樣規格的96孔板，所述固定環的大端外徑稍大于或等于6.8mm，小端外徑稍小于6.8mm即可。所以固定環兩端一定要光滑平整，能緊密壓緊硝酸纖維素膜與96孔板底部。固定環要有一定厚度使其能與硝酸纖維素膜有一定的接觸面積。

優選地，步驟S2所述紅細胞膜的制備方法為：向5～20mL抗凝血中加入10～40mL預冷生理鹽水，離心得紅細胞，按照與紅細胞體積比為30～40∶1的量加入預冷0.01?mol/L，pH7.4?Tric-HCl，4℃放置1～2?h，離心、棄上清，重復3~5?次至無肉眼可見的紅細胞為止，沉淀物用PBS溶液溶解即得紅細胞膜。