[發明專利]一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法與應用

有效

• 申請號: 201310394101.7
• 申請日: 2013-09-03
• 公開（公告）號: CN103487590A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 李守軍;李華濤
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/80
• 分類號: G01N33/80
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

1.一種血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.將硝酸纖維素膜固定于96孔板上；

S2.取1～5μL紅細胞膜包被硝酸纖維素膜，26～37℃干燥10～30min，用100～250μL?3%的脫脂乳封閉96孔板15～45min；

S3.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL待檢血清溶液，26～37℃反應30～60min；

S4.洗板、拍干后向孔中加入100～200μL酶標二抗溶液，?37℃反應30～45min；洗板、拍干后向孔中加入80～150μL底物顯色溶液，顯色5～10min，終止反應，記錄結果。

2.根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于，將硝酸纖維素膜固定于96孔板上的具體步驟為：將硝酸纖維素膜用蒸餾水侵泡，制合適大小的圓形膜，干燥后放入96孔板中，用固定環壓緊硝酸纖維素膜于96孔板底部，放入干燥箱中干燥1～2h即的；

所述固定環為高度為2～4mm，厚度為0.04～0.08mm的圓柱形環，環外徑與96孔板孔的內徑配套，固定環兩端外徑分大小端，大端外徑大于或等于96孔板內孔徑，小端外徑小于96孔板孔內徑。

3.根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于，步驟S2所述紅細胞膜的制備方法為：向5～20mL抗凝血中加入10～40mL預冷生理鹽水，離心得紅細胞，按照與紅細胞體積比為30～40∶1的量加入預冷0.01?mol/L，pH7.4?Tric-HCl，4℃放置1～2?h，離心、棄上清，重復3~5?次至無肉眼可見的紅細胞為止，沉淀物用PBS溶液溶解即得紅細胞膜。

4.根據權利要求3所述檢測方法，其特征在于，所述紅細胞膜的制備方法為：向20mL抗凝血中加入20mL預冷生理鹽水，3000rpm離心15min，棄上清和白細胞層得紅細胞，用預冷生理鹽水重復洗滌紅細胞3次，按照與紅細胞膜體積比為40∶1的量加入預冷0.01?mol/L，pH7.4?Tric-HCl，4℃放置2?h，9?000?r/min，4℃離心20?min，棄上清，重復3~5?次至無肉眼可見的紅細胞為止，沉淀物用0.01?mol/L，pH7.4的?PBS溶液溶解即得。

5.根據權利要求1所述檢測方法，其特征在于，所述洗板具體步驟為向板內加入200～250μL?0.01?mol/L?pH為7.4的?PBS溶液，振搖洗滌3次，每次5min。

6.權利要求1所述血型抗體的間接Dot-ELISA檢測方法的應用，其特征在于，應用于血型鑒定。