[發(fā)明專利]一種全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-苯丙酮酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310392427.6
• 申請日: 2013-09-02
• 公開（公告）號: CN103642743A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳堅;劉龍;堵國成;李江華;侯穎
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-苯丙酮酸的方法，特別是以大腸桿菌表達(dá)重組脫氨酶基因，以此菌株轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)α-苯丙酮酸，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

α-苯丙酮酸(PPA)是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性藥物中間體。PPA還可用于制備苯乳酸，苯乳酸可作為抗菌物質(zhì)。目前PPA生產(chǎn)主要是化學(xué)合成法，主要包括：乙酰氨基肉桂酸水解法、乙內(nèi)酰脲與苯甲醛合成法和海因法。這些方法均需經(jīng)過多步反應(yīng)，對反應(yīng)條件有較高要求，例如高壓、高溫等，產(chǎn)品得率低，對后期分離純化加大了難度，易產(chǎn)生有毒有害產(chǎn)物。

L-氨基酸脫氨酶(EC1.4.3.2，L-AAD)催化L-氨基酸氧化脫氨基，生成相應(yīng)α-酮酸和氨，多為黃素蛋白，二聚體結(jié)構(gòu)。L-氨基酸脫氨酶主要存在于蛇毒和昆蟲毒素中，在細(xì)菌、真菌、藻類中也存在。蛇毒氨基酸脫氨酶是研究最好的脫氨酶，但是價格昂貴，難以大規(guī)模使用。Proteus?mirabilis?KCTC2566有兩種L-氨基酸脫氨酶，一種具有廣泛的底物特異性，能夠催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其對L-苯丙氨酸具有較高催化活性；另一種具有底物限制性，只對堿性氨基酸具有催化活性，尤其是L-組氨酸。大部分細(xì)菌L-氨基酸脫氨酶是胞外分泌型，但是這兩種L-氨基酸脫氨酶都是膜蛋白。

在原核及真核生物中，20%-30%的基因編碼膜蛋白，這些膜蛋白形成許多重要的超分子化合物。膜蛋白在許多疾病中發(fā)揮重要作用，將近半數(shù)藥物的靶蛋白是膜蛋白。因此近些年，膜蛋白成為蛋白質(zhì)組學(xué)及結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究焦點(diǎn)。由于膜蛋白在雙層膜上定位、插入以及正確折疊都是非常復(fù)雜的過程，表達(dá)系統(tǒng)的選擇非常重要，膜蛋白表達(dá)有很多瓶頸尚未解決。

目前國外學(xué)者已對這兩種L-氨基酸脫氨酶進(jìn)行分離純化及性質(zhì)研究，但是目前尚未有利用此酶生產(chǎn)PPA的報道。

利用L-氨基酸脫氨酶為膜蛋白這一特性，我們開發(fā)了一種新的PPA生產(chǎn)模式-全細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)化。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化相比分離酶具有如下優(yōu)勢：全細(xì)胞生物催化劑更容易制備，成本低；比分離酶更穩(wěn)定，不易受環(huán)境溫度、pH等因素影響，使用方便；轉(zhuǎn)化過程中不產(chǎn)生有毒害產(chǎn)品，不產(chǎn)生其他副產(chǎn)物；轉(zhuǎn)化過程一步生成PPA，不需經(jīng)多步反應(yīng)。相比之下現(xiàn)有某些化學(xué)合成法雖然得率能夠達(dá)到90%以上，但是能耗高、步驟繁瑣、污染嚴(yán)重。因此全細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一節(jié)能環(huán)保的生產(chǎn)方式具有極大潛力，有望實現(xiàn)低能耗、高效率、高純度、無污染的工業(yè)化PPA生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)PPA的方法，是將來源于P.mirabilis?KCTC2566的脫氨酶基因在大腸桿菌中異源表達(dá)，以此菌株高效轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)PPA，從而解決了工業(yè)化PPA生產(chǎn)高成本、低得率、污染嚴(yán)重的問題。

所述P.mirabilis?KCTC2566購買于Korea?Collection?for?Type?Cultures，KCTC。

所述大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建是以P.mirabilis?KCTC2566的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示的脫氨酶基因后連接到載體pET-20b(+)，將所得重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。具體地，是以P.mirabilis?KCTC2566基因組DNA為模板，使用如下引物擴(kuò)增目的基因：

正向引物：5’CGCGGATCCATGAACATTTCAAGGAGAAAGCTAC3’，下劃線部分為BamH?I酶切位點(diǎn)；反向引物：5’CCGCTCGAGTTACTTCTTAAAACGATCCAAACTAA3’，下劃線部分為Xho?I酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物純化、酶切后，與載體pET-20b(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-pma。

所述基因工程菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化高效生產(chǎn)α-苯丙酮酸的方法，是將種子培養(yǎng)液按1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD為1.0，添加終濃度0.4mM的IPTG，30℃誘導(dǎo)5h，收集細(xì)胞，取1.4-25.2g/L細(xì)胞、4-24g/L底物L(fēng)-苯丙氨酸，pH5-9，25-45℃條件下，轉(zhuǎn)化6-36h。優(yōu)選底物L(fēng)-苯丙氨酸濃度為14.0g/L，細(xì)胞濃度為8.4g/L，35℃，轉(zhuǎn)化16h。