[發明專利]攜帶miR-199*的脂肪間充質干細胞在肝癌細胞治療中的應用及其構建方法

無效

• 申請號: 201310390748.2
• 申請日: 2013-08-30
• 公開（公告）號: CN103451155A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 樓國華;劉艷寧;陳智
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0775;C12N15/63;A61K35/12;A61P35/00;A61P35/04
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

技術領域

本發明涉及成體干細胞與細胞治療領域，涉及間充質干細胞的新應用，具體涉及攜帶miR-199*（miR-199a/b-3p）的脂肪來源的間充質干細胞的構建方法，及其在肝癌細胞治療中的應用。

背景技術

原發性肝癌(hepatocellular?carcinoma,HCC)的死亡率一直高居不下，其對化療和放療的敏感性差，過去10年中僅發現有1種激酶抑制劑型化療藥物索拉非尼（sorafenib）對肝癌治療有所幫助。因此探索肝癌的新型基因或分子標志物，并開發針對該靶點的治療策略是肝癌治療的重要問題。

最近，miRNA與肝癌的關系日益受到關注。已有多項研究發現，在腫瘤組織中存在多種miRNAs的表達失調，這些miRNA可能通過對細胞惡性表型相關基因的表達調控而參與腫瘤的發生發展。而在肝癌組織中，miR-21、miR-26、miR-29、miR-122、miR-155、miR-221/222和miR-199a*(miR-199a/b-3p)等多種miRNAs分別以細胞凋亡逃逸、細胞周期調控、浸潤和轉移調控、炎癥調控等方式影響肝癌進程。這其中，miR-199a*是最具價值的肝癌治療靶點之一。研究發現，HCC的發生發展伴隨miR-199a*的低表達，而外源導入miR-199a*則可抑制肝癌細胞增殖，并可增加其化療敏感性、降低其侵襲性；另外還發現miR-199a*還可抑制HCV和HBV的復制，而HCV和HBV的持續感染與肝癌相關，因此miR-199a*有望作為肝癌防治的新靶點。

發明內容

本發明的目的是提供構建攜帶miR-199a*的AMSC的方法，并應用于制備肝癌細胞治療制劑中的應用，可以達到抑制腫瘤增殖，轉移的效果，從而為臨床應用攜帶miR-199*的AMSC進行肝癌靶向治療提供依據。

本發明公開了攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞的構建方法，包括如下步驟：

1）脂肪來源的間充質干細胞的制備：脂肪組織經DPBS清洗后，用I型膠原酶37℃消化1小時，然后室溫離心后棄去上層油脂和液體，細胞沉淀以DPBS重懸洗滌2遍后離心收集細胞，接種在含5%胎牛血清的低糖DMEM培養基的培養瓶內，細胞貼壁增殖接近80%融合時，進行消化、傳代，依此法傳代2-4次，達到純化和擴增間充質干細胞的目的，收集細胞凍存、復蘇備用；

2）攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞的制備：has-miR-199*表達質粒通過電轉法導入AMSC，以EGFP指示轉染效率（轉染效率約70%），以轉染無關has-miRNA的表達質粒作為對照，以表達質粒所帶的Blasticidine抗性基因進行篩選。篩選4-6周后可獲得穩定表達miR-199*的攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞。

進一步的，所述脂肪組織為成人脂肪組織，所述miR-199*為has-miR-199*。

攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞具有間充質干細胞的基本特性。

攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞可提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性。

攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞在制備肝癌細胞治療制劑中的應用。（所述攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞為攜帶miR-199*的人脂肪來源的間充質干細胞）

攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞在制備肝癌細胞化療增敏制劑中的應用。

進一步的，所述的肝癌細胞為HepG2,Huh7和Hep3B。

進一步的，所述制劑可控制肝癌細胞增殖和轉移。

進一步的，所述制劑可提高肝癌對化療藥物的敏感性。

進一步的，所屬制劑的劑型為注射劑。

下面對本發明做進一步的說明。

本發明公開了一種構建攜帶miR-199*的脂肪來源的間充質干細胞（AMSC-miR-199*）的方法，包括如下步驟：

1）脂肪來源的間充質干細胞（AMSC）的制備：吸脂手術采集的成人脂肪組織經DPBS清洗后，用Ⅰ型膠原酶37℃消化1小時，然后室溫離心后棄去上層油脂和液體，細胞沉淀以DPBS重懸洗滌2遍后離心收集細胞，接種在含5%胎牛血清的低糖DMEM培養基的培養瓶內，細胞貼壁增殖接近80%融合時，進行消化、傳代，依此法傳代2-4次，達到純化和擴增間充質干細胞的目的，收集細胞凍存、復蘇備用。