[發明專利]一種真菌C2H2型鋅指蛋白BbAzf及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除載體

有效

• 申請號: 201310388680.4
• 申請日: 2013-08-31
• 公開（公告）號: CN103421101A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 范艷華;裴炎;唐桂榮;周永紅;張永軍
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C07K14/37
• 分類號: C07K14/37;C12N15/31;C12N15/80;C12N15/66;C12N1/15;A01N63/04;A01P3/00;C12R1/645
• 代理公司: 重慶博凱知識產權代理有限公司 50212
• 代理人: 張先蕓

技術領域

本發明涉及一種真菌C2H2型鋅指蛋白BbAzf。

本發明涉及球孢白僵菌BbAzf的基因敲除載體，含有抗除草劑的篩選基因Bar。

本發明涉及球孢白僵菌BbAzf基因的敲除突變體，該突變體可以大量產生紅色色素——卵孢素。與球孢白僵菌野生型菌株相比，BbAzf突變體對農業害蟲菜青蟲有較高的毒力。

背景技術

真菌發育的一個重要方面是產生次生代謝物。這些次生代謝物盡管對真菌的生長和發育不是必需的，但卻是真菌在生態環境中的穩定或致病動植物不可缺少的。部分真菌次生代謝物在生物技術和醫藥領域有著重要的作用，展示了廣譜的抗生素、抗病毒、抗腫瘤、抗高膽固醇和免疫抑制活性，如青霉素和環孢菌素等；而另外一些則對動物或人類健康構成了威脅，如黃曲霉素和T-2毒素等。因此，長期以來，真菌次生代謝物的研究一直受到研究者的廣泛關注。昆蟲病原真菌在生長發育或致病昆蟲的過程中產生的一些次生代謝物被證明與真菌的毒力相關，如白僵菌素（Beauvericin）、破壞素等。Xu?et?al.從球孢白僵菌中克隆了白僵菌素的非核糖體酶合成基因BbBeas，并分析了該基因對菌株毒力的影響。結果顯示，當敲除BbBeas后，菌株不能產生球孢白僵菌素，對Galleria?mellonella，Helicoverpa?zea，Spodoptera?exigua等昆蟲的毒力顯著降低。在接種后7天，野生型菌株可造成約70～98％的死亡率，而基因敲除突變株僅有10～23％的死亡率(Xu?et?al.，2008)。此外，Wang?et?al.通過比較基因組學手段克隆了綠僵菌的破壞素（Destruxins）合成酶基因DtxS1。研究發現產破壞素株系的宿主范圍廣，而不產破壞素株系的宿主范圍窄(Wang?et?al.，2012)。這些研究表明，昆蟲病原真菌產生的對昆蟲具有毒性的次生代謝物在真菌侵染致病昆蟲的過程中發揮著重要的作用，可望利用其提高菌株的毒力或開發出新型的生物農藥。但目前從昆蟲病原真菌中鑒定出來的與真菌毒力相關的次生代謝物還相對較少，已知的多數次生代謝物也僅知道其化學結構，缺乏對其合成基因及調控機理的深入認識。

球孢白僵菌是我國應用較為廣泛一種昆蟲病原真菌，在發育過程中會產生一種次生代謝物——卵孢素(Eyal?et?al.，1994)。卵孢素是一種紅色的羥基苯醌衍生物，具有抗菌和抗腫瘤活性(Mao?et?al.，2010)，其活性機制主要是通過還原反應改變蛋白質和氨基酸上的巰基，從而使酶失活或者抑制ATPase活性。卵孢素也可以抑制Herpes?simplex病毒－IDNA聚合酶的活性，從而抑制病毒活性（for?a?review，Strasser?et?al.，2000）。此外，研究發現卵孢素具有殺蟲活性。盡管卵孢素在醫藥領域及害蟲防治等領域具有廣闊的應用前景，但目前僅確定了卵孢素的化學結構，對其合成基因、調控機制及與菌株毒力關系的認識還是空白。目前，卵孢素人工合成的成本較高，還沒法進行大規模的生產，因此建立卵孢素的生物合成途徑及調控機制可為生物發酵生產卵孢素奠定基礎。

卵孢素已證實具有殺蟲、抗菌及抗病毒活性，在害蟲防治、植物抗病及醫藥衛生領域具有廣闊的應用前景，但利用人工合成的方法獲得卵孢素成本較高。目前關于真菌中卵孢素的生物合成途徑及調控機制還不清楚，也沒有通過基因工程手段獲得高產卵孢素菌株的報道，因此利用真菌發酵法獲得卵孢素的得率較低。

發明內容

針對現有技術存在的上述不足，本發明的目的在于提供一個球孢白僵菌的C2H2型鋅指蛋白基因BbAzf，解決人工合成成本較高，不能進行大規模的生產的問題。

本發明還提供所述C2H2型鋅指蛋白基因BbAzf的基因敲除載體。

實現上述目的，本發明采用如下技術方案實現：

一種真菌C2H2型鋅指蛋白BbAzf，其特征在于，具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列和SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

進一步，本發明還提供一種球孢白僵菌BbAzf的基因敲除載體，其特征在于，通過破壞BbAzf基因以提高球孢白僵菌中卵孢素的產量，獲得BbAzf的球孢白僵菌基因敲除子；

破壞該基因的方法，包括如下步驟：

1）以球孢白僵菌基因組作模板擴增得到BbAzf基因的左臂BbAzfL和右臂BbAzfR，亞克隆到pGEM-T上，獲得pGEM-BbAzfL和pGEM-BbAzfR；