[發明專利]酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記和SCAR標記及其獲得方法

無效

• 申請號: 201310386037.8
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN103468675A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 劉樹文;李凱;何玲
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明屬于釀酒微生物生物技術工程，特別涉及酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記、SCAR標記及其獲得方法。?

背景技術

蘋果酸-乳酸發酵(Malolactic?Fermentation，簡稱MLF)是葡萄酒釀造中非常關鍵的二次發酵過程，它包括有機酸、糖類代謝、多糖和氨基酸的代謝作用，還涉及到許多酶類，比如糖苷酶、酯酶、蛋白酶等，這些代謝反應產生多樣化的揮發性物質，從而改善和修飾葡萄酒的感官特性。MLF過程主要有酒酒球菌主導。酒酒球菌發揮優良特性必須要抵抗葡萄酒中惡劣的生存環境，產生一定的抗脅迫能力，比如抵抗低pH值脅迫、高酒精濃度脅迫、高S0₂濃度脅迫和營養物質匱乏脅迫等。酒酒球菌在葡萄酒中的抗脅迫能力的大小也就是存活量的多少，是影響MLF活性的關鍵，因此對不良環境的抵抗能力成為優良菌株選育的重要參照指標。?

酒酒球菌的抗酸機制可以作為生物化學和分子生物學方法選育優良菌株的理論基礎，然而酒酒球菌抵抗脅迫時有相當復雜的反應機制，目前本領域技術人員尚不清楚酒酒球菌在受到酸脅迫時的具體反應機制。?

發明內容

針對現有技術的缺陷，本發明公開了獲得酒酒球菌抗酸相關基因片段的穩定遺傳標記的方法，以及基于此方法獲得的RAPD標記和SCAR標記。本發明所獲得的標記序列是與酒酒球菌抗酸基因連鎖的穩定遺傳標記，為進一步揭示酒酒球菌抗酸基因的調控機制奠定理論基礎，并且作為一級信息源可以用于選育優良的酒酒球菌菌株。?

為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的：?

首先，本發明公開了酒酒球菌菌株的RAPD標記，其序列全長為1000bp，序列的堿基排列見序列表1所示。該序列具有特異性，與酒酒球菌抗酸性狀有緊密聯系，可以用作酒酒球菌抗酸性研究的標記序列。?

其次，在上述RAPD標記的基礎上，本發明還公開了酒酒球菌菌株的SCAR標記，將酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記采用SCAR引物擴增得到，其序列如序列表2所示。?

其中所用SCAR引物的序列為：SAl：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT。?

相對于RAPD標記，SCAR標記穩定性更好、可重復性強。SCAR標記表現為擴增片斷的有無，是一種顯性標記，能更方便、快捷用于快速檢測大量個體。?

其中，上述的RAPD標記到SCAR標記的轉化條件為PCR擴增反應，采用Taq酶1.0U、SCAR引物0.4μmol／L、dNTP160μmol／L、Mg²⁺3.0mmol／L、RAPD標記DNA模板10ng；反應程序為94℃預變性5min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環；72℃延伸5min。?

相應的，在上述基礎上，本發明公開了獲得酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記的方法，包括下述步驟：?

1)以酒酒球菌為實驗材料，篩選抗酸和酸敏菌株；?

2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因組DNA；?

3)基于BSA法與RAPD法，獲得與酒酒球菌抗酸相關基因連鎖的RAPD標記；?

4)回收抗酸性RAPD特異片段，與pMD119-T載體連接后測序得到RAPD標記。?

其中，步驟1)篩選抗酸和酸敏菌株的方法為將菌株活化復壯后以相同接種量接種到不同pH梯度的培養基中靜置培養，測定菌液在600nm下的吸光值，通過吸光值的大小差異篩選抗酸菌株和酸敏菌株。?

其中，步驟2)的CTAB法是生物領域常用的用來提取DNA的方法，采用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖，在高離子強度的溶液中(>0.7mol／L?NaCl)與蛋白質和多聚糖形成復合物，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使DNA分離出來。?

其中，步驟3)首先等量混合抗酸群和酸敏群兩個近等位群體的基因組DNA，構建兩個近等位基因池；然后采用隨機引物對兩組基因組DNA進行PCR擴增，篩選出在兩個近等位基因池之間能擴增出差異條帶的隨機引物，在單菌株中驗證表現兩個基因池差異性的隨機引物的特異性；重復上述過程直至篩選出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能穩定擴增的引物。?