[發明專利]酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記和SCAR標記及其獲得方法

無效

• 申請號: 201310386037.8
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN103468675A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 劉樹文;李凱;何玲
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記，其特征在于所述RAPD標記的序列為序列表1。

2.酒酒球菌抗酸相關基因的SCAR標記，其特征在于以權利要求1的酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記采用SCAR引物擴增得到的，SCAR標記的序列為序列表2。

3.根據權利要求2所述的SCAR標記，其特征在于所用SCAR引物的序列為：SA1：TCTGGACGGACAATATAAGTCA；SA2：TCTGGACGGAACATTGGGAGAT。

4.根據權利要求2所述的SCAR標記，其特征在于上述PCR擴增反應的條件為Taq酶1.0U、引物0.4μmol／L、dNTP160μmol／L、Mg²⁺3.0mmol／L、RAPD標記DNA模板10ng；反應程序為94℃預變性5min；94℃變性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，30個循環；72℃延伸5min。

5.獲得酒酒球菌抗酸相關基因的RAPD標記的方法，其特征在于包括下述步驟：

1)以酒酒球菌為實驗材料，篩選抗酸和酸敏菌株；

2)以CTAB法提取酒酒球菌的基因組DNA；

3)基于BSA法與RAPD法，獲得與酒酒球菌抗酸相關基因連鎖的RAPD標記；

4)回收抗酸性RAPD特異片段，與pMD119-T載體連接后測序得到RAPD標記。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于步驟1)篩選抗酸和酸敏菌株的方法為將菌株活化復壯后以相同接種量接種到不同pH梯度的培養基中靜置培養，測定菌液在600nm下的吸光值，通過吸光值的大小差異篩選抗酸菌株和酸敏菌株。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于步驟3)首先等量混合抗酸群和酸敏群兩個近等位群體的基因組DNA，構建兩個近等位基因池；然后采用隨機引物對兩組基因組DNA進行PCR擴增，篩選出在兩個近等位基因池之間能擴增出差異條帶的隨機引物，在單菌株中驗證表現兩個基因池差異性的隨機引物的特異性；重復上述過程直至篩選出只在抗酸菌株和酸敏菌株二者之一中能穩定擴增的引物。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述能穩定擴增的引物序列為S200：TCTGGACGGA。

9.獲得酒酒球菌抗酸相關基因的SCAR標記的方法，其特征在于包括下述步驟：以SCAR引物將RAPD標記進行PCR擴增。