[發(fā)明專利]一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關(guān)蛋白的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310385454.0
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN103472182A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 滕年軍;張鳳姣;黃至喆;陳發(fā)棣;房偉民;蔣甲福;管志勇;陳素梅;劉兆磊
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

1.一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關(guān)蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：??????

1）以栽培菊花作母本，野菊作父本進行遠緣雜交，分別于授粉后12?d和18?d剪下已授粉的花序進行取樣，授粉后12?d時取發(fā)育正常、飽滿的子房，授粉后18?d時分別取發(fā)育正常、飽滿的子房及發(fā)育異常、不飽滿的子房；取樣后立即在液氮中預(yù)處理1~2?h，然后于-80℃貯存；

2）將步驟1）所取得的樣品分別用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)，得到授粉后12?d發(fā)育正常飽滿子房的蛋白質(zhì)、授粉后18?d發(fā)育正常飽滿子房的蛋白質(zhì)和發(fā)育異常不飽滿子房的蛋白質(zhì)，于-80℃保存；

3）將授粉后12?d發(fā)育正常飽滿子房的蛋白質(zhì)、授粉后18?d發(fā)育正常飽滿子房的蛋白質(zhì)和發(fā)育異常不飽滿子房的蛋白質(zhì)分別運用iTRAQ與質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定差異蛋白，并進行生物信息學分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的栽培菊花為‘雨花落英’，所述的野菊為菊花腦。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1）所述遠緣雜交方法為：選定父母本，在母本上選取發(fā)育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時去雄，即將內(nèi)輪兩性管狀小花全部去除，同時剪去舌狀花花瓣直到可見柱頭，并嚴格進行套袋，待母本柱頭伸出并開叉呈現(xiàn)銳角和分泌黏液時，于晴天10~15時收集已套袋的父本新鮮花粉，對母本進行授粉，授粉后立刻對母本雌蕊繼續(xù)套袋隔離。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2）中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì)的過程為：取樣品在液氮預(yù)冷的研缽中迅速研磨至粉末狀，加入提取液制成混合液，將混合液裝入離心管中，放在冰上并在搖床上振蕩后，在15,000?g，4℃下離心15?min，取上清液，向上清液中加入洗滌液Ⅰ，充分震蕩混勻，-20℃靜止0.5~1.5h；然后在15,000?g，4℃下離心15?min，棄上清，向沉淀中加洗滌液Ⅱ洗滌，-20℃靜止30?min以上，重復(fù)用洗滌液Ⅱ洗滌1~2次后冷凍干燥沉淀，將獲得的蛋白質(zhì)干粉于-80℃長期保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的提取液為：8M尿素、2%硫脲、1%?Trition?X-100、50?mM?NaCl、20?mM?Tris，pH?=8.0；所述的洗滌液Ⅰ為：-20℃預(yù)冷丙酮加0.07%?DTT和10%?TCA；所述的洗滌液Ⅱ為：-20℃預(yù)冷丙酮加0.07%?DTT。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟3）中運用iTRAQ與質(zhì)譜技術(shù)快速鑒定差異蛋白主要包括以下步驟：樣品前處理、第一維高pH反相色譜分離和第二維低pH反相色譜質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)采集，在利用生物信息學手段對數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)上，獲得與胚胎敗育密切相關(guān)的蛋白；所述的樣品前處理包括以下步驟：蛋白定量、蛋白純化、蛋白酶解、肽段iTRAQ標記、去除殘留標記試劑、脫鹽。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的第一維高pH反相色譜分離的過程為：將樣品前處理后得到的肽段粉末使用高pH流動相A溶解上樣，使用梯度洗脫，0-30?min，流動相由5%B升至35%B；30-32?min，由35%B升至80%B；32-35?min保持80%B，35-36?min由80%B降至5%B，并保持14?min平衡色譜柱，高pH反相梯度共50?min；流速為200?μl/min，色譜柱保持在室溫條件，使用紫外214?nm波長檢測；色譜系統(tǒng)死時間(t0)為2?min，由4?min開始每隔2?min使用EP管收集餾分，最后第32-36?min收集為一管，共計收集15管，分別干燥成肽段粉末；所述的高pH流動相A為20?mM甲酸銨，pH=10.0，色譜純氨水調(diào)節(jié)pH；高pH流動相B為20?mM甲酸銨，90%乙腈，pH=10.0，色譜純氨水調(diào)節(jié)pH。