[發明專利]一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法

有效

• 申請號: 201310385454.0
• 申請日: 2013-08-29
• 公開（公告）號: CN103472182A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發明（設計）人: 滕年軍;張鳳姣;黃至喆;陳發棣;房偉民;蔣甲福;管志勇;陳素梅;劉兆磊
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

技術領域

本發明涉及菊花雜交育種與蛋白質組學領域，涉及菊花遠緣雜交后胚胎在不同發育時期正常與敗育胚胎差異蛋白的快速檢測與鑒定方法，具體地說涉及一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法。

背景技術

菊花原產中國，是我國十大傳統名花、世界四大切花和十大盆花之一，在花卉生產中占有十分重要的地位。目前，國內菊花品種高達數千個，但多數觀賞性狀優良的品種各種抗性較差，而多數近緣種屬的野生資源中卻含有許多栽培菊品種所缺乏的優良性狀，為此運用栽培品種與野生資源進行遠緣雜交的方法將是改良菊花抗性的有效途徑。

然而，已有研究表明，菊花遠緣雜交中經常遇到各種生殖障礙，受精前障礙(pre-fertilization?barriers)和受精后障礙(post-fertilization?barriers)是導致菊花遠緣雜交結實率低的主要因素，其中受精后障礙發生更為普遍，即雜交后雖能夠完成受精作用過程，但胚胎發育過程遇到障礙，導致發育停止或者完全壞死，即胚胎敗育，最終引起雜交不結實。

目前的研究主要集中在對胚胎發育的形態結構、組織化學等方面，如胚胎敗育發生的時期和胚胎敗育的組織結構特征等，很少從更深層次上開展研究。由于這些形態、組織等方面的變化從根本上說還是由基因和蛋白表達水平上的變化所引起，因此為了能真正弄清胚胎敗育的機理，除了從細胞與結構水平上開展相關的研究外，還需要從分子水平上開展更為深入的研究?？刂浦参锱咛グl育的基因通常高達數千種，直接從基因水平上著手很難找到控制胚胎敗育的相關基因。而在最近10多年興起與逐漸完善的蛋白質組學(proteomics)技術一方面可以同時分辨和鑒定上千個甚至更多的蛋白質，另一方面因為胚胎敗育與蛋白質表達密切相關，因此，蛋白質組學將是研究植物胚胎敗育較為理想的手段，準確、快速地鑒定出正常胚胎與敗育胚胎的關鍵差異蛋白有十分重要的意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法。鑒定菊花正常胚胎與敗育胚胎差異蛋白的方法，為克服菊花遠緣雜交受精后障礙研究提供分子基礎，實現不同菊屬間各種優良基因的轉移。

本發明的目的通過以下技術方案實現：

一種鑒定菊花遠緣雜交胚胎敗育相關蛋白的方法，包括以下步驟：?

1）以栽培菊花作母本，野菊作父本進行遠緣雜交，分別于授粉后12?d和18?d剪下已授粉的花序進行取樣，授粉后12?d時取發育正常、飽滿的子房，授粉后18?d時分別取發育正常、飽滿的子房及發育異常、不飽滿的子房；取樣后立即在液氮中預處理1~2?h，然后于-80℃貯存；

2）將步驟1）所取得的樣品分別用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質，得到授粉后12?d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18?d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質，于-80℃保存；

3）將授粉后12?d發育正常飽滿子房的蛋白質、授粉后18?d發育正常飽滿子房的蛋白質和發育異常不飽滿子房的蛋白質分別運用iTRAQ與質譜技術快速鑒定差異蛋白，并進行生物信息學分析。

所述的栽培菊花為‘雨花落英’，所述的野菊為菊花腦。

所述步驟1）所述遠緣雜交方法為：選定父母本，在母本上選取發育良好的花蕾，在舌狀花剛露色時去雄，即將內輪兩性管狀小花全部去除，同時剪去舌狀花花瓣直到可見柱頭，并嚴格進行套袋，待母本柱頭伸出并開叉呈現銳角和分泌黏液時，于晴天10~15時收集已套袋的父本新鮮花粉，對母本進行授粉，授粉后立刻對母本雌蕊繼續套袋隔離。

步驟2）中用TCA/丙酮沉淀法提取蛋白質的過程為：取樣品在液氮預冷的研缽中迅速研磨至粉末狀，加入提取液制成混合液，將混合液裝入離心管中，放在冰上并在搖床上振蕩后，在15,000?g，4℃下離心15?min，取上清液，向上清液中加入洗滌液Ⅰ，充分震蕩混勻，-20℃靜止0.5~1.5h；然后在15,000?g，4℃下離心15?min，棄上清，向沉淀中加洗滌液Ⅱ洗滌，-20℃靜止30?min以上，重復用洗滌液Ⅱ洗滌1~2次后冷凍干燥沉淀，將獲得的蛋白質干粉于-80℃長期保存。