[發明專利]一種快速檢測金銀花成分摻偽量的方法

在審

• 申請號: 201310384569.8
• 申請日: 2013-08-28
• 公開（公告）號: CN104419755A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 蘭青闊;王永;劉征輝;趙新;朱珠;徐石勇;陳銳;郭永澤
• 申請（專利權）人: 天津市農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于藥物分析領域，具體涉及中成藥、食品、保健品中金銀花成分摻偽量的檢測方法，是一種利用焦磷酸測序技術對金銀花及其偽品標志性核酸位點定量檢測的方法。

背景技術

來源純正、品質優良的藥用植物資源是中藥現代化和標準化生產的重要前提之一。近年來不斷出現中藥材摻偽事件，不僅損害了中醫藥的信譽和消費者的信心，更使誤病害人，造成巨大的經濟損失。本發明以大宗藥材金銀花為材料，基于DNA條形碼標記中Sentinel-base位點，結合焦磷酸測序分析技術，建立快速、高通量、自動化的金銀花摻偽鑒別方法，為規范、監管藥材市場提供技術支撐。

焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)是應用于DNA序列分析的新一代技術。在遺傳分析中，可以提供核酸序列信息的分子檢測技術是“黃金標準”，其權威性比其他DNA分析方法如Northem雜交，基因芯片和實時定量PCR(Taqman探針)技術更好。其原理是：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。該技術用于測量短DNA鏈序列，是目前唯一能實時得到定量序列結果的技術，兼有PCR技術的靈敏性和測序技術的準確性，具有準確性高，重復性好，自動化程度高，操作簡單的特點，非常適合用于對蔬菜雜交品種種子純度的鑒定。迄今為止，尚未有成功利用焦磷酸測序技術鑒定中藥摻偽量的報道。

發明內容

本發明的目的在于公開了一種金銀花成分摻偽量檢測方法，為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案：

用于檢測金銀花成分摻偽量的PCR擴增及焦磷酸測序特異性引物，包括引物正向序列：5’-Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3’，反向引物序列：5’-AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3’，測序引物序列：5’-GATGAGAAATATAACGAATT-3’。

本發明所述快速檢測金銀花成分摻偽量的方法，該方法以供試樣品基因組DNA為模板，對已知目標片段進行PCR擴增分析，結合應用焦磷酸測序技術對標志性核酸位點進行AQ分析及摻偽量計算，其包括如下步驟：

(1)采用引物正向、反向序列的2條PCR特異引物及Master?Mix，加入供試樣品模板DNA進行PCR擴增；其中的PCR擴增反應體系：擴增反應的總體積為50μL，其各種成分分別為：2×Master?Mix25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL，用滅菌去離子水補齊至50μL；

反應程序：95℃預變性10min，94℃變性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循環50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(2)采用焦磷酸測序特異性引物，對供試樣品的PCR擴增產物進行焦磷酸測序分析；其中的焦磷酸測序反應體系：測序反應的總體積為100μL，其中各種成分分別為：PCR產物50μL，Sepharose?Beads3μL，Binding?Buffer47μL，10μmol／L測序引物1.2μL，Annealing?Buffer38.8μL；

(3)測序時間8～10min，測序結束后使用“AQ”模式對標志性核酸位點進行分析，通過觀察第二個測序堿基“T”和第三個測序堿基“G”的等位基因頻率判定樣品中金銀花含量摻偽情況，其中“T”堿基頻率為樣品中金銀花偽品的含量，“G”堿基頻率為樣品中金銀花正品的含量，兩者之和等于一。

本發明所述的檢測方法，其中的Binding?Buffer47μL指的是：10mmol／L?Tris-HCl，2mol／L?NaCl，l?mmol／L?EDTA，0.1％Tween20，pH7.6的溶液；Annealing?Buffer38.8μL指的是：20mmol／L?Tris-AC，2mmol／L?MgAc2，pH7.6的溶液。

本發明所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為100μmol／L的貯存液，工作濃度為10μmol／L。

本發明所述的檢測方法，模板DNA指的是從待測樣品提取的基因組DNA。