[發明專利]一種快速檢測金銀花成分摻偽量的方法

在審

• 申請號: 201310384569.8
• 申請日: 2013-08-28
• 公開（公告）號: CN104419755A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 蘭青闊;王永;劉征輝;趙新;朱珠;徐石勇;陳銳;郭永澤
• 申請（專利權）人: 天津市農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.用于鑒定金銀花成分摻偽量的PCR擴增及焦磷酸測序特異性引物，其特征在于，包括引物正向序列：5’-Biotin-ATTATTTATCCTCCCCCTTTTATC-3’，反向引物序列：5’-AACATTTCCGCTCAGATCTATTT-3’，測序引物序列：5’-GATGAGAAATATAACGAATT-3’。

2.一種采用權利要求1所述特異性引物，快速鑒定金銀花成分摻偽量的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)采用權利要求1所述的2條PCR特異引物及Master?Mix，加入供試樣品模板DNA進行PCR擴增；其中的PCR擴增反應體系：擴增反應的總體積為50μL，其各種成分分別為：2×Master?Mix25μL，10μmol／L引物各1μL，模板DNA2μL，用滅菌去離子水補齊至50μL；

反應程序：95℃預變性10min，94℃變性30S，55℃退火30S，72℃延伸45S，循環50次，最后72℃延伸7min，4℃保存；

(2)采用權利要求1所述的焦磷酸測序測序特異性引物，對供試樣品的PCR擴增產物進行焦磷酸測序分析；其中的焦磷酸測序反應體系：測序反應的總體積為100μL，其中各種成分分別為：PCR產物50μL，Sepharose?Beads3μL，Binding?Buffer47μL，10μmol／L測序引物1.2μL，Annealing?Buffer38.8μL；

(3)測序時間8～10min，測序結束后使用“AQ”模式對標志性核酸位點進行分析，通過觀察第二個測序堿基“T”和第三個測序堿基“G”的等位基因頻率判定樣品中金銀花含量摻偽情況，其中“T”堿基頻率為樣品中金銀花偽品的含量，“G”堿基頻率為樣品中金銀花正品的含量，兩者之和等于一。

3.如權利要求2所述的鑒定方法，其中每條引物分別配制成濃度為100μmol／L的貯存液，工作濃度為10μmol/L。