[發(fā)明專利]一種水產(chǎn)品加工添加劑及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310381791.2
• 申請日: 2013-08-28
• 公開（公告）號: CN103408659A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳新華;敖敬群;李艷霞
• 申請（專利權(quán)）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/22;C12P21/02;A23L1/03;C12R1/84
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森;何加友

1.一種水產(chǎn)品加工添加劑，其特征在于為大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F基因在酵母工程菌巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F中的重組表達(dá)產(chǎn)物，在表達(dá)過程出現(xiàn)兩次不同程度的糖基化；所述巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F已于2013年5月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M2013226。?

2.如權(quán)利要求1所述一種水產(chǎn)品加工添加劑，其特征在于所述水產(chǎn)品加工添加劑包括但不限于魚漿加工添加劑、魚糜加工添加劑、蝦漿加工添加劑、蝦糜加工添加劑。?

3.如權(quán)利要求1所述一種水產(chǎn)品加工添加劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：?

1）挑取巴斯德畢赤酵母Pichia?pastoris?SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F單菌落在菌體富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀至2～6，離心后加誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基懸浮至OD₆₀₀為2，以甲醇溶液為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，振蕩培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物離心收集上清，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和Western-blotting分析證實大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F基因在上清中得到了分泌型表達(dá)；?

2）利用鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)(Ni-NTA)純化上訴誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)物中大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F基因的重組表達(dá)產(chǎn)物：巴斯德畢赤酵母Pichia?pastoris?SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)物離心取上清，加入NaCl至終濃度為0.1～0.3M，再加入咪唑至終濃度為5～10mM,4℃放置過夜，離心取上清液于0.45μm濾膜過濾，每100mL濾膜過濾后的濾液加入1mL鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)于4℃結(jié)合過柱，控制流速在2～5mL/min，用5倍柱體積含10～20mM咪唑的結(jié)合緩沖液洗滌后再用含20～40mM咪唑的結(jié)合緩沖液洗滌雜蛋白至OD₂₈₀小于0.01，加入1mL洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，重復(fù)1次，得到的純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測后為大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑F基因酵母表達(dá)產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng)透析去除咪唑后即為水產(chǎn)品加工添加劑。?

4.如權(quán)利要求3所述一種水產(chǎn)品加工添加劑的制備方法，其特征在于在步驟1）中，所述菌體富集培養(yǎng)基的組成為BMG+復(fù)合維生素+PTM1，所述BMG：1%的酵母粉，2%的蛋白胨，100mL/L的磷酸鉀緩沖液，1%的甘油；所述復(fù)合維生素，g/L：泛酸鈣0.08，葉酸0.0004，肌醇0.4，煙酸0.08，對-氨基苯甲酸0.04，吡哆醇0.08，核黃素0.04，硫胺素0.08；所述PTM1，g/L：CuSO₄·5H₂O6.0g，NaI0.08g，MnSO₄·H₂O3.0g，鉬酸鈉·2H₂O0.2g，硼酸0.02g，CoCl0.5g，ZnCl₂20.0g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O65.0g，生物素0.2g，H₂SO₄5.0ml。?

5.如權(quán)利要求3所述一種水產(chǎn)品加工添加劑的制備方法，其特征在于在步驟1）中，所述離心的條件是于3000r/min離心5min。?