[發(fā)明專利]一種水產(chǎn)品加工添加劑及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310381791.2
• 申請(qǐng)日: 2013-08-28
• 公開（公告）號(hào): CN103408659A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳新華;敖敬群;李艷霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 國(guó)家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號(hào): C07K14/81
• 分類號(hào): C07K14/81;C07K1/22;C12P21/02;A23L1/03;C12R1/84
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森;何加友

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及水產(chǎn)品加工添加劑，尤其是涉及一種來源于大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑F基因酵母表達(dá)產(chǎn)物的水產(chǎn)品加工添加劑及其制備方法。

背景技術(shù)

我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，水產(chǎn)養(yǎng)殖與水產(chǎn)品加工業(yè)是我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的重要組成部分。水產(chǎn)品加工包括以魚、蝦、貝、蟹等的可食用部分制成冷凍品、腌制品、干制品、罐頭食品等的食品加工業(yè)和以食品加工的下腳料、廢棄物等為原料的非食品加工業(yè)。水產(chǎn)品加工添加劑主要是指在水產(chǎn)食品加工業(yè)中為改善食品品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及為保存和加工工藝的需要而加入的天然或化學(xué)合成物質(zhì)。

在水產(chǎn)品加工尤其是魚糜及魚糜制品加工過程中，由凝膠劣化現(xiàn)象導(dǎo)致的產(chǎn)品品質(zhì)下降、營(yíng)養(yǎng)流失、顏色改變是困擾魚糜生產(chǎn)行業(yè)的一大難題。凝膠劣化主要是由于魚肉中殘留的半胱氨酸類組織蛋白酶在魚糜凝膠的加熱制備過程降解肌球蛋白所致(Olafsdottir?G,Martinsdóttir?E,et?al.Methods?to?evaluate?fish?freshness?in?research?and?industry.Trends?in?Food?Science&Technology,1997,8(8):258-265)。目前，國(guó)內(nèi)水產(chǎn)品加工行業(yè)通常通過在加工的各個(gè)階段添加各種化學(xué)試劑來遏制凝膠劣化現(xiàn)象，這些化學(xué)試劑盡管可以在一定程度上幫助凝膠的形成并增強(qiáng)凝膠強(qiáng)度，但不能從根本上解決由內(nèi)源性蛋白酶引起的凝膠劣化問題。本發(fā)明主要涉及一種來源于大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F的水產(chǎn)品加工添加劑產(chǎn)品，該產(chǎn)品由大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F在巴斯德畢赤酵母中的重組表達(dá)產(chǎn)物制得，可有效抑制魚漿、魚糜、蝦漿、蝦糜、蟹漿、蟹糜等加工過程中的凝膠劣化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種水產(chǎn)品加工添加劑及其制備方法。

所述水產(chǎn)品加工添加劑為大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F基因在酵母工程菌巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F中的重組表達(dá)產(chǎn)物，其理論分子量約16kDa，在表達(dá)過程出現(xiàn)兩次不同程度的糖基化；所述巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F已于2013年5月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO：M2013226，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。

所述水產(chǎn)品加工添加劑包括但不限于魚漿加工添加劑、魚糜加工添加劑、蝦漿加工添加劑、蝦糜加工添加劑等，所述水產(chǎn)品加工添加劑能夠有效抑制魚漿、魚糜、蝦漿、蝦糜等制品中半胱氨酸類蛋白酶對(duì)肌球蛋白的降解，增強(qiáng)以上水產(chǎn)品的凝膠強(qiáng)度、質(zhì)地、凝膠白度及持水性能等。

所述水產(chǎn)品加工添加劑的制備方法，包括如下步驟：

1）挑取巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F單菌落在菌體富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀至2～6，離心后加誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基懸浮至OD₆₀₀為2，以甲醇溶液為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，振蕩培養(yǎng)后，將培養(yǎng)物離心收集上清，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE和Western-blotting分析證實(shí)大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F基因在上清中得到了分泌型表達(dá)；

2）利用鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)純化上訴誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)物中大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑cystatin?F基因的重組表達(dá)產(chǎn)物：巴斯德畢赤酵母（Pichia?pastoris）SMD1168/pPICZαA-Lyccystatin?F誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)物離心取上清，加入NaCl至終濃度為0.1～0.3M，再加入咪唑至終濃度為5～10mM,4℃放置過夜，離心取上清液于0.45μm濾膜過濾，每100mL濾膜過濾后的濾液加入1mL鎳離子金屬鰲合親和層析介質(zhì)于4℃結(jié)合過柱，控制流速在2～5mL/min，用5倍柱體積含10～20mM咪唑的結(jié)合緩沖液洗滌后再用含20～40mM咪唑的結(jié)合緩沖液洗滌雜蛋白至OD₂₈₀小于0.01，加入1mL含500～1000mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，重復(fù)1次，得到的純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后為大黃魚半胱氨酸蛋白酶抑制劑F基因酵母表達(dá)產(chǎn)物，該產(chǎn)物經(jīng)透析去除咪唑后即為水產(chǎn)品加工添加劑。