[發明專利]一種蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法

有效

• 申請號: 201310379785.3
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103439500A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 馬建中;侯雪艷;高黨鴿;呂斌
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

技術領域

本發明涉及一種酶在皮膠原纖維中的檢測方法，具體涉及一種蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法。

背景技術

隨著制革業污染問題的日趨嚴重，環保型制革用材料的研究引起了制革研究者的廣泛關注。其中，酶制劑作為一種高效、環保的材料，在制革中的應用歷史已久，主要利用水解酶去除皮中的蛋白質、脂肪等非膠原成分，為后期工序中材料的滲透與結合做準備(Swarna?V.Kanth;R.Venba;B.Madhan;N.K.Chandrababu;S.Sadulla.Cleaner?tanning?practices?for?tannery?pollution?abatement：Role?of?enzymes?in?eco-friendly?vegetable?tanning.J.Clean?Prod.,2009,17:507–515;Puvanakrishnan?R.Ecofriendly?lime?and?Sulfide?free?enzymatic?dehairing?of?skins?and?hides?using?a?bacterial?alkaline?protease.Chemosphere.,2008,70:1015–1024)。

動物皮作為一種不溶性的特殊底物，在整個制革過程中要保護皮張纖維結構的完整性，酶處理皮的影響因素很多，除了酶作用條件的影響外，酶分子量對其在皮中的滲透及其水解纖維間質有著非常重要的作用。比如不同大小分子量的酶在皮中的滲透速度和程度有差異，進而導致其對皮的水解差異；可根據制革不同工序皮膠原纖維的特殊結構選擇適合分子量的酶通過復合協同作用，達到更好的處理效果。因此涉及分子量等理論研究將對酶在皮革中的應用提供理論指導作用。

在制革用酶制劑的研究中，皮革酶處理過程中酶在皮中的滲透程度隨著時間的變化而改變，如果有一種方法可以檢測不同分子量大小的酶在皮中滲透狀態及對皮中纖維間質作用程度，將會對酶在制革中的應用研究提供很大理論支持。最早，有人將酶脫毛豬皮中不同層次的蛋白酶轉移到酪蛋白上，酶與酪蛋白反應產生白色斑點，通過斑點可知酶的滲透深度和數量（Yang?Y.Z.Test?of?enzyme?in?dehaired?pelt.China?Leather,2002,31:20–22），但是，對于酶處理中已經失去活性的蛋白酶，這種方法難以檢測到其滲透性。

發明內容

本發明的目的在于提供一種蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，該方法適用于各種蛋白酶，且能夠在皮處理的不同時間觀察酶在皮中的滲透及分布狀態，同時可用于比較不同分子量的酶分子在皮中的滲透方式及滲透速度。

為達到上述目的，本發明采用的技術方案包括以下步驟：

1）以pH值為7.0～9.0的緩沖液為溶劑，分別配制酶溶液和異硫氰酸熒光素溶液；

2）向酶溶液中滴加異硫氰酸熒光素溶液混合均勻，使得到的反應體系中酶與異硫氰酸熒光素的質量比為100：（0.5～5.0），然后于4℃下避光反應10h，得到反應液；

3）將反應液裝入分子截流范圍小于酶分子量的透析袋中，然后放入pH值為7.0～9.0的緩沖液中震蕩透析直到透析得到的析出液中不存在游離的異硫氰酸熒光素，停止透析，此時透析袋中剩余物為FITC標記酶溶液；

4）將透析袋中的FITC標記酶溶液取出后用pH值為7.0～9.0的緩沖液稀釋，得到濃度為0.4-1mg/mL稀釋后的FITC標記酶溶液；向稀釋后的FITC標記酶溶液中放入剪掉毛的皮塊，在水浴震蕩器中于室溫避光震蕩，震蕩結束后取出處理過的皮塊，然后用蒸餾水沖洗處理過的皮塊表面以除去游離的異硫氰酸熒光素，得到FITC標記酶處理后的皮塊；將FITC標記酶處理后的皮塊用冷凍切片機冷凍切片，并將切片封固在載玻片上用以在熒光顯微鏡下觀察酶在皮中的分布狀態。

所述的步驟1）、步驟3）和步驟4）中的緩沖液均為磷酸鹽緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

所述的步驟1）中的酶為2709堿性蛋白酶、Genecor?TanG蛋白酶、Genecor?SoakL蛋白酶或Genecor?LimeG蛋白酶。

所述的步驟1）中的酶溶液的濃度為2mg/mL，異硫氰酸熒光素溶液的濃度為1mg/mL。

所述的步驟3）中震蕩透析時每間隔2h換1次pH值為7.0～9.0的緩沖液；停止透析時，震蕩透析得到的析出液在480nm處吸光度為0。

所述的步驟4）中每10-30g剪掉毛的皮塊加入20-50mL稀釋后的FITC標記酶溶液。