[發明專利]一種蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法

有效

• 申請號: 201310379785.3
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103439500A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 馬建中;侯雪艷;高黨鴿;呂斌
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

1.一種蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）以pH值為7.0～9.0的緩沖液為溶劑，分別配制酶溶液和異硫氰酸熒光素溶液；

2）向酶溶液中滴加異硫氰酸熒光素溶液混合均勻，使得到的反應體系中酶與異硫氰酸熒光素的質量比為100：（0.5～5.0），然后于4℃下避光反應10h，得到反應液；

3）將反應液裝入分子截流范圍小于酶分子量的透析袋中，然后放入pH值為7.0～9.0的緩沖液中震蕩透析直到透析得到的析出液中不存在游離的異硫氰酸熒光素，停止透析，此時透析袋中剩余物為FITC標記酶溶液；

4）將透析袋中的FITC標記酶溶液取出后用pH值為7.0～9.0的緩沖液稀釋，得到濃度為0.4-1mg/mL稀釋后的FITC標記酶溶液；向稀釋后的FITC標記酶溶液中放入剪掉毛的皮塊，在水浴震蕩器中于室溫避光震蕩，震蕩結束后取出處理過的皮塊，然后用蒸餾水沖洗處理過的皮塊表面以除去游離的異硫氰酸熒光素，得到FITC標記酶處理后的皮塊；將FITC標記酶處理后的皮塊用冷凍切片機冷凍切片，并將切片封固在載玻片上用以在熒光顯微鏡下觀察酶在皮中的分布狀態。

2.根據權利要求1所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟1）、步驟3）和步驟4）中的緩沖液均為磷酸鹽緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。

3.根據權利要求1所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟1）中的酶為2709堿性蛋白酶、Genecor?TanG蛋白酶、Genecor?SoakL蛋白酶或Genecor?LimeG蛋白酶。

4.根據權利要求1或3所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟1）中的酶溶液的濃度為2mg/mL，異硫氰酸熒光素溶液的濃度為1mg/mL。

5.根據權利要求1所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟3）中震蕩透析時每間隔2h換1次pH值為7.0～9.0的緩沖液；停止透析時，震蕩透析得到的析出液在480nm處吸光度為0。

6.根據權利要求1所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟4）中每10-30g剪掉毛的皮塊加入20-50mL稀釋后的FITC標記酶溶液。

7.根據權利要求1或6所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟4）剪掉毛的皮塊是由制革用皮制成的。

8.根據權利要求7或所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟4）中制革用皮為預浸水去肉后的牛皮或羊皮。

9.根據權利要求7所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟4）中避光震蕩的時間為12h-24h。

10.根據權利要求1所述的蛋白酶在皮革處理中的可視化跟蹤檢測方法，其特征在于：所述的步驟4）中切片封固時用的封固劑為甘油與pH值=7.4的磷酸鹽緩沖液的混合液，且混合液中甘油和pH值=7.4的磷酸鹽緩沖液的體積比為9:1。