[發明專利]一種犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法

無效

• 申請號: 201310378688.2
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN103436619A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 喻華英;石長青;焦海宏;任敏
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，該犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法包括以下步驟：

步驟一、犢牛發生腹瀉后病料的采集與標記；

步驟二、細菌的增菌，細菌的鑒定和選擇性特殊培養基培養，菌體的處理；

步驟三、設計兩對診斷性引物eaeA，P1：5’-CTGAACGGCGATTACGCGAA-3’；P2：5’-CCAGACGATACGATCCAG-3’，預期擴增出的目的片段大小；bfpA基因，P1：5’-TGTATATTGGGCAGACC-3’；P2：5’-CAGGGCGTATTATGTAGA-3’，預期擴增出的目的片段大小；

步驟四、PCR擴增反應；

步驟五、記錄革蘭氏染色鏡檢結果，大腸桿菌在麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板生長結果，毒力基因eaeAPCR結果；

步驟六、將eaeA所測序列與GeneBank中的序列進行比對，對eae序列進行分析，對核苷酸序列分析；

步驟七、將蛋白序列在NCBI中進行比對，得到該蛋白的結構域。

2.如權利要求1所述的犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，病料的采集與標記的具體方法為：

犢牛發生腹瀉后，用干凈竹簽選取含有粘液、膿血病變成分的糞便，也可用棉簽取黏附在肛門附近的腹瀉糞便，裝于無菌的容器內，低溫保存，并對病料進行編號，一月齡1-24號，10天內25-30號。

3.如權利要求1所述的犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，細菌的增菌方法為：

在無菌操作臺，用接種環取采集的糞便于LB液體培養基中，放入氣浴恒溫振蕩器中，于37℃緩慢震蕩過夜。

4.如權利要求1所述的犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，細菌的鑒定和選擇性特殊培養基培養的具體方法為：

用接種環挑取增菌液，在普通瓊脂平板進行劃線；

置于37℃恒溫培養箱內培養24h，每板選取單個菌落，進行革蘭氏染色鏡檢，選取陰性菌；

選取革蘭氏陰性單個菌落接種麥康凱瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板、37℃恒溫培養箱內培養24h，觀察結果。

5.如權利要求1所述的犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，菌體的處理的方法為：

將每一株菌接在兩支LB培養液中，過夜培養，一支進行5次離心，棄上清，收集菌體，加入100μL滅菌水，懸浮菌體后100℃煮沸5min，離心作為PCR模版，在-70℃冰箱保存。

6.如權利要求1所述的犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，擴增反應條件：

eaeAPCR反應條件：95℃預變性5min，94℃變性1min，44.4℃退火1min，72℃延伸1min，共30個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存；

bfpAPCR反應條件：95℃預變性5min，94℃變性1min，51℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環，最后72℃延伸10min，4℃保存；

PCR產物用1%瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，凝膠成像系統拍照觀察結果。

7.如權利要求1所述的犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，經革蘭氏染色鏡檢，得到革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌，用選擇性特殊培養基培養和生化方法鑒定革蘭氏陰性菌。

8.如權利要求1所述的犢牛腹瀉病中鑒定非典型性大腸桿菌的方法，其特征在于，判定非典型性EPEC的方法為：

從分離鑒定的大腸桿菌中，利用PCR技術篩選出四株大腸桿菌含有eaeA基因、bfpA無帶，判定為非典型性EPEC。