[發(fā)明專利]一種稻曲病菌薄壁分生孢子的平板培養(yǎng)制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310378599.8
• 申請(qǐng)日: 2013-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN103436480A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張君成;覃茜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N3/00
• 分類號(hào): C12N3/00
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司 45104
• 代理人: 王素娥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)和生物技術(shù)。具體是一種稻曲病菌薄壁分生孢子的平板培養(yǎng)制備方法。

背景技術(shù)

在大多數(shù)真菌病害系統(tǒng)中，病原菌的繁殖體除了具有繁殖擴(kuò)大自身種群數(shù)量等作用外，更重要的是擁有與寄主互作識(shí)別，并發(fā)動(dòng)侵染寄主的功能，因此在許多重要的植物病害研究過程中，都需要使用病原菌的繁殖體作試驗(yàn)材料，顯而易見，高效便捷的繁殖體材料的培養(yǎng)制備方法，將非常有利于研究工作的順利開展。稻曲病已成為我國(guó)水稻生產(chǎn)的一種重大病害，稻曲病菌的繁殖體包括有性態(tài)的子囊孢子、無性態(tài)的厚壁分生孢子和薄壁分生孢子三種類型。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，至今還未見有通過培養(yǎng)該病菌而獲取子囊孢子的有效報(bào)道；培養(yǎng)獲取厚壁分生孢子也存在較大的技術(shù)難度，而且厚壁分生孢子存在休眠現(xiàn)象，使用非常不方便；因此，至今的有關(guān)研究所用的繁殖體主要是使用該病菌的薄壁分生孢子。

至今，大家熟知的稻曲病菌薄壁分生孢子的培養(yǎng)制備方法，主要有2種。一種為二期培養(yǎng)法，即先將病菌菌絲體在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后將菌絲體轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，整個(gè)過程一般需要15天以上。另一種為三期培養(yǎng)法，即先將病菌菌絲體在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后將菌絲體轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，接著再將振蕩培養(yǎng)產(chǎn)物倒入固體培養(yǎng)基進(jìn)行雙相培養(yǎng)，整個(gè)過程一般需要20天以上。這2種方法有共同步驟，都需要進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)。

這2種方法都能有效制備獲得稻曲病菌薄壁分生孢子，但在實(shí)踐上它們均存在一些弊病，如耗時(shí)較長(zhǎng)；耗工較多；需要振蕩培養(yǎng)設(shè)備；培養(yǎng)產(chǎn)物中的薄壁分生孢子屬多世代孢子的混合物；培養(yǎng)產(chǎn)物混合液中包含有大量的菌絲團(tuán)、菌體代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基組分等，往往需要濾掉菌絲和沉淀孢子等后續(xù)處理步驟才適合使用，同時(shí)由于培養(yǎng)產(chǎn)物呈粘稠狀態(tài)，沉淀孢子往往需要高速離心機(jī)設(shè)備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是依據(jù)稻曲病菌薄壁分生孢子萌發(fā)后具有特殊的生長(zhǎng)發(fā)育特性，提供一種稻曲病菌薄壁分生孢子的平板培養(yǎng)制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：

一種稻曲病菌薄壁分生孢子的平板培養(yǎng)制備方法，操作步驟如下：

1.初始薄壁分生孢子液的制備：

a）初始薄壁分生孢子的來源：用大家熟知的二期培養(yǎng)方法，用菌絲體通過振蕩培養(yǎng)方式，獲得含有大量薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物；或者采用培養(yǎng)田間病稻粒上的新鮮厚壁分生孢子，獲得含有大量薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物。

b)孢子純化處理：將獲得的薄壁分生孢子的培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行孢子純化處理，純化處理方法是，用2層紗布過濾去除培養(yǎng)產(chǎn)物中的菌絲；然后將過濾液進(jìn)行離心處理并收集沉淀孢子，即能去除培養(yǎng)產(chǎn)物中的培養(yǎng)基成分和菌體外泌物質(zhì)；接著用無菌水將沉淀孢子懸浮洗滌，再進(jìn)行一次離心處理，獲得純凈的孢子團(tuán)。用無菌水將孢子團(tuán)懸浮分散均勻即成為薄壁分生孢子液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板的制備：

采用PSA培養(yǎng)基的半量成分作為產(chǎn)孢培養(yǎng)基，產(chǎn)孢培養(yǎng)基為：馬鈴薯100g；蔗糖10g；瓊脂20g；水1000ml，通過常規(guī)滅菌后倒成培養(yǎng)皿平板，即制成產(chǎn)孢培養(yǎng)用的產(chǎn)孢平板。

3.產(chǎn)孢培養(yǎng)：

取步驟1)保存?zhèn)溆玫谋”诜稚咦右旱斡趥浜玫漠a(chǎn)孢培養(yǎng)基平板面上，用平滑的玻璃棒抹涂平板面，使孢子充分均勻分布于平板面上，回蓋后轉(zhuǎn)入溫度為28℃條件下培養(yǎng)5天。

4.新的薄壁分生孢子的收集：

上步驟培養(yǎng)5天后，產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出大量直徑約為0.5～1.5mm的產(chǎn)生薄壁分生孢子的小菌落，此時(shí)收集孢子為最適時(shí)機(jī)。收集方法是，取清水注在產(chǎn)孢平板面上，然后，用普通毛刷洗刷產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板表面菌落，使得菌落上的孢子釋放到水中，將洗刷孢子的水液收集起來，即是培養(yǎng)產(chǎn)物稻曲病菌薄壁分生孢子。

5.薄壁分生孢子純化處理：

將所收集的培養(yǎng)產(chǎn)物薄壁分生孢子進(jìn)行孢子純化處理，純化處理方法是，用2層紗布過濾去除培養(yǎng)產(chǎn)物中的菌絲；然后將過濾液進(jìn)行離心處理并收集沉淀孢子，即能去除培養(yǎng)產(chǎn)物中的培養(yǎng)基成分和菌體外泌物質(zhì)；接著用無菌水將沉淀孢子懸浮洗滌，再進(jìn)行一次離心處理，可獲得非常純凈的薄壁分孢子團(tuán)。用無菌水將這孢子團(tuán)懸浮分散均勻即成為稻曲病菌薄壁分孢子液。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

1.培養(yǎng)制備過程時(shí)間較短，一般僅需要4～6天；

2.操作簡(jiǎn)易便捷，無需振蕩培養(yǎng)設(shè)備；

3.所獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物中的薄壁分生孢子主要是同一世代的孢子；

4.孢子液質(zhì)量較高，無需相關(guān)的凈化處理也適合許多研究工作的使用。

附圖說明

圖1是薄壁分生孢子萌發(fā)早期示意圖。