[發(fā)明專利]一種大型真菌去甲基化育種方法及裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310377815.7
• 申請(qǐng)日: 2013-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN103460993A
• 公開（公告）日: 2013-12-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱巍巍;李莉;池景良;趙新海;張慶華;關(guān)艷麗;鐘麗娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 遼寧省微生物科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): A01G1/04
• 分類號(hào): A01G1/04
• 代理公司: 錦州遼西專利事務(wù)所 21225
• 代理人: 李輝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種大型真菌去甲基化育種方法及裝置。?

背景技術(shù)

大型真菌(macrofungi)是菌物中形成大型子實(shí)體的一類真菌，泛指廣義上的蘑菇(mushroom)或蕈菌(macrofungi)。大型真菌是菌物中的一個(gè)重要類群，很多種類具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，是目前菌物中最有開發(fā)應(yīng)用前景的一類。我國(guó)已有上千年的大型真菌栽培歷史，商業(yè)化栽培的大型真菌品種基本上都是經(jīng)人工育種而獲得。對(duì)于生化途徑清晰度菌株，通過代謝工程策略可以更容易地選擇菌種改良靶點(diǎn)；而對(duì)于生化途徑不清晰的菌株，也可以直接通過基因組改組、核糖體工程和表觀遺傳修飾等手段進(jìn)行遺傳選育，從而獲得理想表型。?

通過遺傳選育手段直接阻斷和高表達(dá)表觀遺傳學(xué)靶點(diǎn)能夠有效地確定目的靶點(diǎn)與表型和次級(jí)代謝生物合成之間的關(guān)系，然而，除了少數(shù)模式真菌外，很多的大型真菌都缺乏高效的遺傳操作系統(tǒng)，因此在目前的技術(shù)條件下，很難使用分子遺傳學(xué)手段直接操縱非模式真菌的表觀遺傳。?

隨著研究的深入，一系列的小分子物質(zhì)被篩選出來(lái)特異性地或者半特異性地抑制表觀遺傳修飾酶類，它們?cè)诤芏啻笮驼婢弦灿休^好的效果。控制表觀遺傳靶點(diǎn)的小分子能夠影響多種生理過程，其中包括對(duì)發(fā)育時(shí)序、表型控制和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控。在真菌細(xì)胞中，DNA?甲基化與去甲基化是受DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA去甲基化酶調(diào)控的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程，利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可激活真菌的沉默基因的表達(dá)，從而改變菌株的表型和次級(jí)代謝產(chǎn)物圖譜。這種方法成本低，誘變率高，能夠同時(shí)進(jìn)行高通量篩選，而且對(duì)菌株的遺傳背景沒有過高要求。目前，DNA去甲基化的操作方法是液體搖瓶法，即把菌株與抑制劑在液體搖瓶中共同培養(yǎng)一段時(shí)間后，取出菌絲體在平板培養(yǎng)皿上涂布篩檢，誘變過程和檢測(cè)過程割裂成兩步。這種方法不但工作量大、周期長(zhǎng)，最主要無(wú)法實(shí)現(xiàn)誘變與檢測(cè)直接掛鉤，很多已經(jīng)發(fā)生改變的菌絲體由于未在培養(yǎng)皿上涂布導(dǎo)致無(wú)法被檢出，效率比較低。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡(jiǎn)單、誘變和檢測(cè)可同步進(jìn)行、檢出效率高的大型真菌去甲基化育種方法及裝置。?

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：?

一種大型真菌去甲基化育種方法，其具體步驟是：

1.1、采用去甲基化育種大型真菌的裝置，有培養(yǎng)皿主體和與該培養(yǎng)皿主體配合使用的培養(yǎng)皿蓋，所述培養(yǎng)皿主體包括底盤和自底盤邊緣向上延伸圍成一圈的側(cè)壁，所述培養(yǎng)皿主體內(nèi)設(shè)有至少一個(gè)與側(cè)壁形成同心環(huán)的環(huán)形隔板將培養(yǎng)皿主體由內(nèi)至外分隔成獨(dú)立的培養(yǎng)區(qū)域；培養(yǎng)皿主體的中心區(qū)域?yàn)閱渭兣囵B(yǎng)基區(qū)域，加入培養(yǎng)基A；與培養(yǎng)皿主體的中心區(qū)域相鄰的誘變區(qū)域及連續(xù)的其他誘變區(qū)域，加入培養(yǎng)基A和抑制劑B；所述培養(yǎng)基A為瓊脂培養(yǎng)基，所述抑制劑B為小分子化學(xué)抑制劑，所述小分子化學(xué)抑制劑為核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或非核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑；

1.2、將待誘變菌株接種于培養(yǎng)皿的單純培養(yǎng)基區(qū)域，在適生長(zhǎng)條件下進(jìn)行倒置培養(yǎng)；

1.3、中心區(qū)域的待誘變菌株菌絲生長(zhǎng)進(jìn)入鄰近的誘變區(qū)域，抑制劑進(jìn)入生長(zhǎng)菌絲產(chǎn)生作用；?

1.4、獲得誘變菌株。

所述獨(dú)立誘變區(qū)域還加入指示劑C、輔助劑D中的至少一種，所述指示劑C為酸堿指示劑，在明確目的性誘變育種時(shí)添加，針對(duì)誘變目的物設(shè)計(jì)加入的指示劑成分，以快速直接的實(shí)現(xiàn)該目的，極大減少工作量；所述輔助劑D為菌株細(xì)胞壁通透性增強(qiáng)成分，以增加抑制劑B進(jìn)入待誘變菌株的接觸量，使誘變更快速。?

所述核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為5-氮雜胞苷、5-氮-2’-脫氧胞苷、5-氟脫氧胞苷及脫氧胞苷衍生物中的一種，所述非核苷類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為聚苯復(fù)合物、4-氨基苯酸衍生物中的一種。?

所述待誘變菌株為大型真菌，所述培養(yǎng)基A為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、麥粒瓊脂培養(yǎng)基、麥芽酵母蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（MYPA）、木屑麩皮蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（SWSA）中的一種。?

所述指示劑C為酚紅、甲基紅、特異基團(tuán)顯色劑中的至少一種，加入指示劑能夠?qū)崿F(xiàn)誘變與特異性目的物檢測(cè)同步；所述輔助劑D為二甲基亞砜或溶菌酶，輔助通透劑能夠增加菌株與抑制劑的接觸量。?

所述環(huán)形隔板的數(shù)目≥2個(gè)，環(huán)形隔板分隔的誘變區(qū)域中抑制劑B濃度由內(nèi)至外遞增，抑制劑濃度不夠未產(chǎn)生誘變，菌絲自由生長(zhǎng)進(jìn)入相鄰更高抑制劑濃度的誘變區(qū)，直至發(fā)生誘變。?