[發明專利]一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法

有效

• 申請號: 201310377238.1
• 申請日: 2013-08-27
• 公開（公告）號: CN104419716B
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 元英進;劉奪;李炳志;王霞;申明華;胡夢龍;杜昊星;蘇皖;宋田青;翟芳;郭雪嬌;郭睿
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/63;C12N1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 王學強

技術領域

本發明涉及合成生物學領域，尤其涉及一種功能模塊構建方法。

背景技術

功能模塊在合成生物學研究中有著至關重要的作用。人工優化重構內源代謝路徑、改造底盤細胞基因組、快速拼裝多個外源基因元件、人工設計構建新生命功能，這些過程均需依托于功能模塊。因此，設計一套標準化、高精度、通用的功能模塊構建及拼裝方法，使得其能夠快速高效地獲取所需模塊，已經成為合成生物學迫切需要的瓶頸技術。

合成生物學亟需的、比較理想的功能模塊構建方法，應該具備如下顯著特點：1）對任意基因元件，無需位點預修飾。2）在構建過程中，始終維持DNA序列的保真性。3）能高效快速將多個模塊組合拼裝在一起。4）能自由決定模塊起止、強度、組合順序。目前已有的一些方法各有其顯著優點，同時也存在著明顯的不足。各個方法的簡介如下：

Biobrick方法是iGEM國際遺傳工程機器設計大賽所采用的模塊構建方法。其特點為：預先對基因元件進行位點修飾，去除EcoR1，Xba1，Spe1，Pst1這四個酶切位點。將帶有EcoR1，Xba1與Spe1，Pst1酶切位點的標準化序列添加到每個基因元件兩側形成標準化位點。對基因元件均采用四種酶的合理搭配進行酶切連接，兩個相鄰的元件會以Xba1與Spe1切出的同尾粘口連接形成“鎖死位點”，不會再被切開，從而將兩個小元件連成一個新的大元件，繼續連接形成功能模塊。

CPEC方法是利用PCR擴增為基因元件添加同源臂，同時以PCR擴增質粒載體，所有的PCR產物混在一個體系中，高溫失活使得PCR產物充分裂解為單鏈DNA。在合適的溫度下退火，單鏈DNA互搭，一定概率形成功能模塊的質粒的單鏈雛形，在Phusion等高保真PCR酶擴增下，以互搭處的DNA序列為引物，擴增出雙鏈模塊質粒。

SLIC方法是利用3’核酸外切酶將多個元件或模塊的PCR片段從3’端消化出一段單鏈DNA，PCR片段主體部分仍為雙鏈形式。這些相互同源互補的單鏈DNA臂在合適的溫度下會退火互搭，在配套功能酶的作用下將多消化的單鏈部分補全，轉化形成完整的質粒。

Gibson方法與SLIC方法原理是完全一致的，只是Gibson方法采用的是5’核酸外切酶消化各個高濃度PCR片段，在同源互補構成質粒后無需擴增直接轉化大腸桿菌，獲得拼裝的完整質粒。

DNA Assembler方法主要用于拼裝單順反子形式的單個片段，即每個片段是一個完整的“同源臂-啟動子-基因元件-終止子-同源臂”PCR產物形式，各個片段與線性化的酵母質粒載體一步轉化釀酒酵母，獲得完整的多模塊質粒。

Golden Gate Assembly方法需要對每個待拼裝的PCR片段進行位點預修飾，去除所使用的位點如Bsa1、BsmB1等。在Golden Gate酶切作用下，各個片段露出4個堿基的一一互補粘性末端，所有片段以唯一的順序連入空質粒載體，形成多模塊質粒。

Standardized Assembly of Transcriptional Units方法是采用Golden Gate酶構建單個酵母表達盒的方法，目前尚不涉及多個模塊的拼裝。對單表達盒的構建，啟動子、基因ORF、終止子元件均來自庫存序列100%正確的質粒，經過一步酶切連接入工具質粒載體，快速構建出任一啟動子與終止子搭配的單個基因模塊。

ΦBT1整合酶拼裝方法是采用ΦBT1、ΦC31等噬菌體整合酶構建的一套模塊拼裝方法。拼裝單元仍為PCR產物，通過在每個PCR片段兩段添加點突變的不同att片段，實現不同片段以唯一順序特異性的拼裝，形成最終質粒。

表1：現有各個方法的優缺點對比如下：（優點用加粗加下劃線表示）

上述各個方法各有其優缺點及使用范圍，合成生物學發展至今，亟需能夠綜合各種方法優點、規避缺點的模塊構建及拼裝方法。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法。

一種標準化、高精度、通用的功能模塊構建方法，包括如下步驟：

（1）將源基因添加具有酶識別與切割功能的標準化位點形成基因元件，將基因元件連入質粒pLD-Blunt中形成帶有基因元件的質粒，進行序列驗證；