[發明專利]MDM2基因受體改造的T細胞的制備方法

無效

• 申請號: 201310376897.3
• 申請日: 2013-08-26
• 公開（公告）號: CN103409373A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 凌丹彥;戴書縉;章萬古
• 申請（專利權）人: 上海易美生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 王潔;鄭暄

技術領域

本發明涉及體外細胞培養技術領域，具體涉及一種MDM2基因受體改造的T細胞（M-CIK）的制備方法。

背景技術

肺癌是當前世界各地發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，在中國無論是新發病例還是死亡病例肺癌都排名首位，其中肺鱗癌約占原發性肺癌的30%左右，是來源于支氣管上皮的一種惡性上皮性腫瘤。雖然治療技術有了很大的提高，但5年生存率沒有明顯改善，除了部分早期的患者，幾乎所有患者最終將出現新的轉移病灶，手術及放化療是其有限的治療方法，不像肺腺癌還有分子靶向藥物等治療手段。因此，尋找新的有效的治療手段，開發新一代的靶向性免疫細胞治療肺鱗癌已成為一種新的趨勢。

自體細胞免疫療法是第四代抗腫瘤過繼細胞免疫治療方法，CIK（cytokine-induced?killer，多種細胞因子誘導的殺傷細胞）細胞是其首選方案。該方法是將人外周血單個核細胞（peripheral?mononuclear?cells，PMNC）在體外用多種細胞因子（如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ等）共同培養一段時間后獲得的一群異質細胞。由于該種細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤優點。回輸的免疫活性細胞可在體內長期生存，監視和清除體內的腫瘤細胞。開創了體細胞過繼免疫治療惡性腫瘤的新方法，在各種腫瘤的治療中已展現出令人鼓舞的效果。

但不可避免地面臨著以下這些問題：沒有解決有效地在體外擴增T細胞的數量的問題，及不能產生足夠量的殺傷腫瘤細胞的細胞因子，從而缺乏有效的殺傷腫瘤細胞的細胞毒性。因此，采用體外擴增T細胞治療肺鱗癌的方法需要有一個新的突破，從而使這些T細胞能產生更強的抗癌能力以及更長期的治療效果。

發明內容

為了解決上述現有技術所存在的問題，提高現有方法所得的CIK細胞對肺鱗癌的特異性和殺傷性，本發明提供了一種MDM2基因受體改造的T細胞的新制備方法以及該制備方法所得的M-CIK細胞，該細胞增殖能力強，MDM2受體表達高，對肺鱗癌細胞具有更強的識別能力和殺傷能力，對治療肺鱗癌具有更強的靶向性作用。

為了實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：

本發明經過廣泛研究和反復試驗發現：1）大多數肺鱗癌過度表達MDM2(murine?double?mimute2)基因，占肺鱗癌總數的62%以上，且在其他類型腫瘤組織中也有陽性表達，促使腫瘤的發生發展，并且MDM2基因過度表達者腫瘤惡性度高，還會造成腫瘤對放療、化療的耐受，與不良預后有關。因此我們選擇MDM2基因作為靶基因，用MDM2基因受體修飾T細胞受體；2）將MDM2基因受體通過慢病毒載體成功轉染入培養成熟的單個核細胞（CIK細胞）后，對表達MDM2受體的CIK細胞進行有效擴增得到M-CIK。

一種MDM2基因受體改造的T細胞的制備方法，包括如下步驟：

（1）將MDM2基因受體通過慢病毒載體轉染入培養成熟的單個核細胞CIK細胞；

（2）使表達MDM2受體的CIK細胞進行有效擴增得到M-CIK細胞，即獲得所述MDM2基因受體改造的T細胞。

較佳的，所述慢病毒載體是用來表達一個由單鏈抗體、跨膜區域和一個細胞內信號區域聯結組成的人造受體，即MDM2基因受體。

較佳的，所述MDM2基因受體是指通過2A肽序列與多種共刺激受體CD28，4-1BBL和CD80等相聯結，從而可以增強MDM2基因受體在識別到肺鱗癌抗原后發出的抗腫瘤信號。

較佳的，所述成熟的單個核細胞是指將人體外周血中提取的單個核細胞采用IFN-γ、IL-1α、IL-2、CD3單抗等細胞因子刺激，培養成為成熟的CIK細胞；

進一步的，所述細胞因子IFN-γ、IL-1α、IL-2、CD3單抗的濃度分別為1000-2000U/ml、100-200U/ml、1000-2000U/ml、50-100ng/ml。

較佳的，所述有效擴增是指所得到的擴增細胞90%以上為有效M-CIK細胞（圖1），50ml外周血14天擴增細胞量在10¹⁰個以上（圖2）。

更佳的，所述有效M-CIK細胞是指MDM2受體表達率在90%以上，CD3+表型在90%以上，CD3+CD56+表型在20%以上（圖3），對肺鱗癌細胞SK-MES-1的殺瘤率（效靶比為10:1）在90%以上（圖4）。

本發明還提供了一種M-CIK細胞。