[發明專利]基于固載的混合蛋白質為篩選庫的蛋白酶底物篩選方法

有效

• 申請號: 201310374698.9
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN104419746A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 鄒漢法;王春麗;葉明亮
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C12N11/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明是一種基于固載的混合蛋白質為篩選庫的蛋白酶底物篩選方法。蛋白酶酶切其底物具有高特異性和高選擇性。固載在固相載體上的蛋白庫中的底物蛋白能夠被蛋白酶酶切，產生的肽段進入溶液，而非底物蛋白不能被酶切仍舊保留在固相載體上，通過固液分離法即選擇性地將底物的酶切肽段與非底物蛋白進行分離，結合生物質譜進行底物蛋白定性定量分析,從而得到特異性蛋白酶的底物蛋白。

背景技術

蛋白酶作為生命體內重要的調節酶，參與細胞增值、分化、凋亡等信號轉導途徑。在生物體特定的生理條件下，蛋白酶被激活，酶切底物蛋白，調節生命活動的整個過程。蛋白酶的異常激活可以產生異常的細胞增值和存活信號而導致疾病的發生。因此，對于蛋白酶底物的研究，有利于了解其參與信號轉導的蛋白種類及相互作用關系，并進一步闡述機理。

通常大規模篩選蛋白酶底物的方法，分為兩種，一種是基于凝膠電泳的方法，另一種是基于蛋白質端基標記的方法。基于凝膠電泳的方法（文獻1：Identification?of?caspase-3degradome?by?two-dimensional?gel?electrophoresis?and?matrix-assisted?laser?desorption/ionization-time?of?flight?analysis.Proteomics2004,4(11),3429-3436.文獻2：Shotgun?proteome?analysis?of?protein?cleavage?in?apoptotic?cells.Proteomics2005,5,21232130.文獻3：Global?mapping?of?the?topography?and?magnitude?of?proteolytic?events?in?apoptosis.Cell2008,134,679691.），是利用體外或者體內蛋白酶酶切的實驗組和未酶切的對照組在SDS-PAGE膠上的位置不同進行比較分析，尋找差異的蛋白酶的底物蛋白進行質譜鑒定。由于疏水性強、難溶的、極堿性的蛋白以及分子量很高或很低的蛋白難以實現較好的膠上分離、分辨分析，而且凝膠電泳實驗整個處理過程繁瑣，對實驗者操作技能要求較高，因此該方法應用受到限制。而基于蛋白質端基標記的底物篩選方法(文獻4：A?quantitative?proteomics?design?for?systematic?identification?of?protease?cleavage?events.Mol.Cell.Proteomics2010,9(10),2327-2333.文獻5：Global?Sequencing?of?Proteolytic?Cleavage?Sites?in?Apoptosis?by?Specific?Labeling?of?Protein?N?Termini.Cell2008,134(5),866-876.),是將體外或者體內蛋白酶酶切反應后的實驗組和對照組分別引入不同的端基標記分子，然后進行選擇性分離富集，將蛋白酶酶切底物的端基標記肽段篩選出來進行分析鑒定。該方法對于酶切位點的定位更加準確可靠，因而得到了迅速的發展。然而，該方法所產生的端基標記的酶切肽段受大量背景肽段干擾，需要選擇性較好的富集材料和標記定量方法，還要進行樣品除鹽等多步操作，容易產生樣品損失，引入一定的誤差。

上述文獻對固載的混合蛋白質為篩選庫的蛋白酶底物篩選方法未作任何記載，也未作任何啟示。

發明內容

本發明的目的在于提供一種準確、可靠、操作簡單的蛋白酶底物的篩選方法，該方法可適用于大規模蛋白酶底物的體外篩選。

為實現上述目的，發明人仔細研究了固載的混合蛋白庫與蛋白酶的特異性酶切作用，發現只有底物蛋白才能被酶切，產生的肽段從固相載體上釋放進入溶液，而非底物蛋白由于不能被酶切而保留在固相載體上，從而實現底物蛋白肽段與非底物蛋白的分離，有效降低了非底物蛋白的背景干擾。

因此，本發明提出一種基于固載的混合蛋白質為篩選庫的蛋白酶底物篩選方法。該方法采用的技術方案為：

一種篩選蛋白酶底物的方法，將蛋白質固載于固相載體上，利用蛋白酶的高特異性酶切反應，以及固液分離操作進行底物肽段篩選，進而通過質譜進行底物蛋白的鑒定。

其中蛋白固載于固相載體表面的過程以及蛋白酶特異性酶切反應的過程可按本領域常規方法操作。