[發明專利]基于固載的混合蛋白質為篩選庫的蛋白酶底物篩選方法

有效

• 申請號: 201310374698.9
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN104419746A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 鄒漢法;王春麗;葉明亮
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C12N11/10
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

1.一種基于固載的混合蛋白質為蛋白庫的蛋白酶底物篩選方法,其特征在于：混合蛋白質通過化學作用鍵合到固相載體上作為篩選蛋白庫，將該蛋白庫與特異性蛋白酶孵育，蛋白庫中與特異性蛋白酶相應的底物蛋白被特異性蛋白酶酶切后所產生的肽段進入溶液，而蛋白庫中與特異性蛋白酶不相應的非底物蛋白不能被特異性蛋白酶酶切而完整的保留在固相載體上，固液分離后，采用生物質譜進行底物肽段定性定量分析，從而得到特異性蛋白酶的底物蛋白信息。

2.按照權利要求1所述的篩選方法，其前提特征在于：蛋白酶與其底物具有高度特異性作用；底物蛋白被酶切后所產生的肽段能夠直接從固相載體上釋放進入溶液，非底物蛋白不能被酶切而仍舊完整地保留在固相載體上。

3.按照權利要求1所述方法，其特征在于：特異性蛋白酶可以是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族（caspase-3,caspase-7,caspase-2,caspse-8等），也可以是金黃色葡萄菌V8蛋白酶（GluC）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、凝血酶（Thrombin）、彈性蛋白酶（Elastase）、組織蛋白酶（Cathepsin?G,Cathepsin?K）等中的一種或二種以上。

4.按照權利要求1所述的篩選方法，其特征在于：

具體操作過程為：

1)固載蛋白庫的構建：混合蛋白質通過化學作用鍵合到固相載體上；

2)底物蛋白酶切反應：將固載的混合蛋白庫與蛋白酶孵育反應后，底物蛋白被酶切后所產生的肽段釋放進入溶液，非底物蛋白不能被酶切而完整的保留在固相載體上；

3)底物蛋白分析鑒定：通過固液分離，得到溶液中的底物蛋白肽段，采用質譜進行底物肽段的定性定量分析。

5.按照權利要求1或4所述方法，其特征在于：所述的混合蛋白質為細胞提取的蛋白質、組織提取的蛋白質等中的一種或二種以上。

6.按照權利要求1或4所述方法，其特征在于：所述的固相載體是酰肼微球（Affi-Hz?hydrazide?Gel,Bio-Rad），蛋白質通過酰肼化學的方法固載于酰肼微球上。

7.按照權利要求1或4所述方法，其特征在于：所述的固相載體是瓊脂糖微球（CNBr-activated?Sepharose4B，GE?Healthcare），蛋白質通過溴化氫法固載于瓊脂糖微球上。

8.按照權利要求3或4所述方法，當蛋白酶為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3或7時，其酶切反應條件為：固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μl,50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4），100mM氯化鈉，5mM或10mM二硫蘇糖醇，1mM乙二胺四乙酸,1%或10%（wt/v）蔗糖,蛋白酶與固載蛋白庫中蛋白質的質量比值（wt/wt）范圍為1:10-1:100,在37℃下反應1h以上；

當蛋白酶為黃色葡萄菌V8蛋白酶、凝血酶、彈性蛋白酶、或組織蛋白酶G時，其酶切反應的條件為：固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μl，150mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4）,50mM氯化鈉,蛋白酶與固載蛋白庫中蛋白質的質量比值（wt/wt）范圍為1:10-1:100，在37℃下反應1h以上。

9.按照權利要求4所述方法，當蛋白酶為基質金屬蛋白酶2時，其酶切反應的條件為：固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μl，150mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸（pH=7.4）,50mM氯化鈉,5mM氯化鈣,10μM氯化鋅，蛋白酶與固載蛋白庫中蛋白質的質量比值（wt/wt）范圍為1:10-1:100，在37℃下反應1h以上。

10.按照權利要求4所述方法，當蛋白酶為組織蛋白酶K時，其酶切反應條件為：固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μl，100mM醋酸鈉(pH=5.5），2.5mM乙二胺四乙酸，2.5mM二硫蘇糖醇，蛋白酶與固載蛋白庫中蛋白質的質量比值（wt/wt）范圍為1:10-1:100，在37℃下反應1h以上。