[發明專利]中國人群CYP21A2基因篩查用試劑盒

有效

• 申請號: 201310374192.8
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103421908A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 陳瑛;劉英華
• 申請（專利權）人: 蘇州市立醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司 32232
• 代理人: 傅靖

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域中基因突變檢測領域，具體涉及一種中國人群21-羥化酶基因CYP21A2常見突變熱點篩查用試劑盒。

背景技術

先天性腎上腺皮質增生癥(Congenital?adrenal?hyperplasia，CAH)在新生兒的發生率為1／16000-20000，屬于一組因類固醇激素生物合成過程中某種酶的先天性缺陷而引起的常見常染色體隱性遺傳病。按照合成酶缺陷的不同，分為17α-羥化酶缺乏癥、21-羥化酶缺乏癥、11β-羥化酶缺乏癥、3β-羥類固醇脫氫酶缺乏癥和他們的供電子體P450氧化還原酶缺乏癥五類，其中21-羥化酶缺乏癥是先天性腎上腺皮質增生癥中最常見的一種類型，約占90％-95％。

21-羥化酶缺乏癥為常染色體隱性遺傳病，其致病基因為21-羥化酶基因(CYP21A2)。該基因位于人類第6號染色體短臂6p21.3的人類白細胞抗原(Human?Leukocyee?Antigen，HLA)III類基因區，由無活性的假基因CYP21A1和有活性的真基因CYP21A2組成，真假基因皆為313kb，真假基因均有10個外顯子和9個內含子，如圖1中B所示，真假基因都是由10個外顯子組成，序列同源性達到98％。P30L和V281L可以引發非經典型腎上腺皮質增生癥，I172N可引發經典單純型腎上腺皮質增生癥，IVS2-13A／C>G表現為經典單純型或經典失鹽型腎上腺皮質增生癥，G110A8nt、1762-1763insT、Q318X表現為經典失鹽型腎上腺皮質增生癥。外顯子和內含子同源性分別達到98％和96％，真假基因串聯排列在C4A和C4B基因的3′端，兩者相距30Kb，C4／CYP2IA1與其端粒側RPI基因和著絲粒側TNXB基因以及他們的截短假基因RP2和TNXA基因串聯構成RCCX模塊(RP-C4-CYP21-TNX)，如圖1中A所示，A是真假基因串聯排列在C4A和C4B基因的3′端，C4／CYP21與其端粒側RP1基因和著絲粒側TNXB基因以及RP2、TNXA基因串聯構成RCCX模塊(RP-C4-CYP21-TNX)。目前CYP21A2基因改變的發生機制尚未完全弄清，研究表明大約95％的CYP21A2基因突變是由于活性基因和其臨近連鎖的假基因相互作用引起的，高度同源性使得在有絲分裂或減數分裂期間可能發生不等互換或重組，而導致基因缺失、插入或點突變，因此，多以常見的突變熱點形式致病，不同突變類型引發的表型有差異(見圖1B)，通過特異性的突變熱點篩查可以對大部分患者明確診斷。另外5％的患者等位基因含有特別的突變，這僅發生在個別的家庭，它們代表了個別人群中的稀有等位基因。

目前CYP21A2基因檢測的主要困難是21-羥化酶真基因CYP21A2和假基因CYP21A1P具有高度的同源性，難于區分。對CYP21A2基因突變主要檢測方法包括Southern雜交、測序、多重連接依賴的探針擴增(MLPA)、等位基因特異性聚合酶鏈反應(Allele-specific?PCR，AS-PCR)、變性高效液相色譜(Denaturing?high-performance?liquid?chromatography，DHPLC)等，由于上述技術存在繁瑣、高成本、低通量，或需要高質量的DNA等問題，臨床應用難度較大。目前，DNA直接測序為確定突變的最重要的方法之一，但是在PCR擴增時由于受同源性很大的假基因的干擾，所以需要很多對引物，對多個片段進行多次擴增反應和多個測序反應。因此有必要建立一種高通量、高效能、低成本的CYP21A2基因突變篩查方法，以實現臨床快速檢測。

MLPA(Multiples?ligation-dependent?probe?amplification)，多重連接依賴探針擴增，是一種在同一反應管內檢測多達50個核苷酸序列的拷貝數變化的方法。MLPA技術本身已經比較成熟，廣泛應用于非整倍體快速篩查、染色體微缺失檢測以及DMD等單基因遺傳病檢測，該法用于檢測腎上腺皮質增生癥也有試劑盒研發出來，但是目前還不穩定，尚無法應用于臨床。

基因分型對21-羥化酶缺乏癥患者基因診斷和胎兒產前患病危險率評估和先天性腎上腺皮質增生癥類型鑒別均有重要意義。許多先進國家在開展血片法新生兒遺傳代謝病篩查的同時，還采用基因診斷法，對21-羥化酶唯一致病基因CYP21A2進行檢測作為第二層次的篩查方法。因此，通過早期CYP21A2基因篩查，對于預測和早期干預治療從而預防21-羥化酶缺乏癥的發生具有重要的臨床應用價值。

發明內容