[發明專利]一種LCD-PCT基因串聯重組表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201310374085.5
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103409447A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 王鳳寰;孟青青;楊慧敏;王玉海
• 申請（專利權）人: 北京工商大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/64;C12N1/21;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉華聯

技術領域

本發明屬于基因重組技術領域，涉及一種LCD-PCT基因串聯重組表達載體及其應用。

背景技術

丙烯酸是一種重要的化工原料，其分子中具有特殊的雙鍵結構和酸性官能團。由于丙烯酸及其衍生物生產的聚合物具有無色透明、有粘性、彈性、對光穩定、不易風化等特點，它們被廣泛應用于涂料、紡織、粘合劑、紙漿處理、上光劑、皮革、纖維、洗滌劑和超吸附材料等領域。

丙烯酸的生產方法已經從最初的以乙炔和一氧化碳為原料的Reppe法和丙烯腈水解法發展為目前主要采用的丙烯氧化法。丙烯氧化法又分兩種，其中一步法是丙烯直接與氧反應生成丙烯酸，而兩步法則是先將丙烯與氧反應生成丙烯醛，再將丙烯醛與氧反應生成丙烯酸，工業上絕大多數用丙烯兩步氧化法。但上述方法均以石化產品為原料，而由于化石資源日漸枯竭導致其價格不斷攀升，同時生產中二氧化碳排放也帶來嚴重的環境問題，丙烯酸的生產模式正逐漸向低污染、低能耗且工藝相對簡單的生物法發展。

丙烯酸的生物合成包括半生物合成法和全生物合成法。半生物法將生物技術與化學方法相結合，可以逐步實現可再生資源對化石資源的替代。一種可行的方法是以可再生資源為原料，采用生物方法將其轉化為生產丙烯酸的中間物質，然后再通過化學方法將中間物質轉化為丙烯酸。如先利用發酵法生產乳酸，再進行乳酸的化學脫水得到丙烯酸。

Paparizos等人在美國專利US4786756A中公開了一種乳酸和乳酸銨到丙烯酸的催化轉化，其采用AlPO₄作催化劑，在N₂流保護下，摩爾比為1∶17.5∶7.2的乳酸、水、N₂的混合物從頂部注入340℃在固定床反應器中，丙烯酸的產率為43.3%。另外，還有一種研究思路是以化石資源為底物進行發酵，與工業上的兩步氧化法相比，這種生產方式也可實現能源的節約。

趙孝先等人（利用微生物轉化丙烯腈生產丙烯酸的研究，山東大學學報：自然科學版，1994，29：217～223.）從長期受丙烯酸相關產品生產工廠污水污染的淤泥中分離到能把丙烯腈轉化成丙烯酸的菌株，該菌株屬于假單胞菌屬，發酵時分批補加丙烯腈作為腈水解酶的誘導物，反應歷時4h，丙烯腈的轉化率高達96.3%。

丙烯酸的半生物合成法雖然相比于傳統的化學合成法有降低環境污染、簡化生產工藝的優點，但是仍存在一些問題如乳酸的化學脫水成本較高，丙烯腈、丙烯酰胺的獲得依然需要以化石燃料為基礎等。因此，研究者開始將研究的重點放在丙烯酸的生物法合成上。

生物法可分為直接發酵法和間接發酵法。直接發酵法是從糖出發生成丙烯酸，而間接發酵法則是以生物質發酵生成的產品如乳酸和3-羥基丙酸等為原料，再進一步轉化來制取丙烯酸。乳酸是生產丙烯酸較為合適的可再生中間原料，目前可用于生物法轉化乳酸生產丙烯酸的菌種有丙酸梭菌（Clostridium?propionicum），其體內存在著乳酸和丙烯酸之間的轉換，其代謝途徑如圖一所示（Danner?H,Urmos?M,Gatrner?M,et.al.Biotechnological?production?of?acrylic?acid?from?biomass.Appl?Biochem?Biotechnol,1998,46:70-72.）。

王晨飛等人（丙酸梭菌簡易培養及電轉化方法，生物加工過程，2009，8(5)：35～38）對丙酸梭菌進行厭氧培養，在發酵液中添加D-乳酸作為碳源（終濃度3g/L），對發酵液樣品進行HPLC檢測，丙烯酸產生量尚不理想，這是由于在丙酸梭菌的代謝途徑中，丙烯酸只是中間產物，因而大部分會在菌體內被繼續代謝產生丙酸，致使產物中丙烯酸的濃度很低。

最近的研究發現，自然界中，特別是某些海洋微生物可利用DMSP（二甲基巰基丙酸內鹽）酶解生成丙烯酸和二甲基巰。該途徑見于糞產堿桿菌（Alcaligines?faecalis）中，岳陽等人（Cloning?of?amidase?gene?from?Rhodococcus?erythropolis?and?expression?by?distinct?promoters?in?Bacillus?subtilis.Journal?of?Molecular?Catalysis?B:Enzymatic，2009，56(2):89～95.）嘗試應用基因工程方法對糞產堿桿菌基因組文庫進行篩選，期望獲得二甲基巰基丙酸裂解酶，實現丙烯酸的制備過程，但實驗未獲得陽性克隆。