[發明專利]一種LCD-PCT基因串聯重組表達載體及其應用

有效

• 申請號: 201310374085.5
• 申請日: 2013-08-23
• 公開（公告）號: CN103409447A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 王鳳寰;孟青青;楊慧敏;王玉海
• 申請（專利權）人: 北京工商大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/64;C12N1/21;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 北京聿宏知識產權代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;劉華聯

1.一種LCD-PCT基因串聯重組表達載體，其含有編碼乳酰輔酶A脫水酶的LCD基因和編碼丙烯酰輔酶A轉移酶的PCT基因。

2.根據權利要求1所述的串聯重組表達載體，其特征在于：

所述PCT基因的堿基序列如SEQ?ID?NO:1所示；

所述LCD基因的堿基序列如SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3所示。

3.一種根據權利要求1或2所述的LCD-PCT基因串聯重組表達載體的構建方法，其包括：

步驟A，以丙酸梭菌基因組DNA為模板進行PCR擴增LCD-PCT基因；

步驟B，以步驟A中的PCR擴增產物構建LCD-PCT基因串聯重組表達載體。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：在步驟A中采用擴增引物進行PCR擴增，其中，

上游引物為：5’-GAATGAGTTTAACACAAGGCATGAAAGCAAAA-3’；

下游引物為：5’-TCAGGACTTCATTTCCTTCAGACCCATTAAG-3’。

5.一種采用權利要求1或2所述的LCD-PCT基因串聯重組表達載體或根據權利要求3或4所述的方法構建的LCD-PCT基因串聯重組表達載體制備LCD-PCT重組基因工程菌的方法，其包括：以LCD-PCT基因串聯重組表達載體轉化大腸桿菌感受態細胞，并在其中進行丙烯酰輔酶A轉移酶和乳酰輔酶A脫水酶的表達，制得LCD-PCT重組基因工程菌。

6.一種根據權利要求5所述的方法制得的LCD-PCT重組基因工程菌，其特征在于：所述重組基因工程菌的菌體中含有乳酰輔酶A脫水酶和丙烯酰輔酶A轉移酶。

7.一種根據權利要求6所述的LCD-PCT重組基因工程菌在催化D-乳酸轉化為丙烯酸中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其包括：

步驟一，培養LCD-PCT重組基因工程菌；

步驟二，將步驟一獲得的LCD-PCT重組基因工程菌的菌體進行破碎處理，制得能夠催化D-乳酸轉化為丙烯酸的LCD-PCT催化活性液；

步驟三，在無氧條件下，向含有D-乳酸的反應液中加入LCD-PCT催化活性液催化D-乳酸進行厭氧反應，制得丙烯酸。

9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于：

在步驟一中，采用IPTG誘導表達乳酰輔酶A脫水酶LCD和丙烯酰輔酶A轉移酶PCT；

在步驟三中，所述D-乳酸的濃度為50-100mM。

10.根據權利要求8或9所述的應用，其特征在于：在步驟三中，所述D-乳酸與所述LCD-PCT催化活性液的體積比為25:1-50:1。