[發明專利]帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法

有效

• 申請號: 201310370195.4
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN103412131B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發明（設計）人: 劉北忠;王慧;鐘梁;朱新瑜;馬鵬鵬;胡秀秀;高遠梅;張曦
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學附屬永川醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所11308
• 代理人: 秦力軍

技術領域

本發明涉及生物領域，特別涉及蛋白的檢測技術，特別涉及帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法。

背景技術

急性早幼粒細胞白血病（acute?promyeolic?leukemia,APL）是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，是急性髓細胞白血病的一個特殊類型，發病迅速，致死率高，在FAB分型系統中被定義為M3型。大量臨床研究發現，約97％的APL發生特征性的t(15;17)(15q22;17q21)染色體易位，形成早幼粒細胞白血病-維甲酸受體α融合基因（PML-RARα）。該基因表達的PML-RARα融合蛋白是APL發生發展的分子基礎。但PML-RARα融合蛋白并非始終以整體的形式發揮作用。Lane等^[2]發現，中性白細胞彈性蛋白酶(Neutrophil?Elastase，NE)可將PML-RARα融合蛋白裂解成52KDa的PML(NLS-)和61KDa的NLS-RARα兩種變異蛋白。并且已經有文獻報道，PML-RARα轉染入在早期髓細胞中，很容易發展成為APL白血病細胞，將其轉染入晚期髓細胞，結果卻不能發展為APL細胞。Lane等的后繼研究也表明，在不含NE的早期髓細胞中，單純導入的PML-RARα未被裂解，其發生APL的概率僅為2%～3%，遠低于富含NE的早期髓細胞。因此我們可以通過檢測血細胞中的切割產物NLS-RARα蛋白，為早期診斷APL提供依據,本研究就是初步探討NLS-RARα蛋白的檢測方法，為以后運用于臨床奠定基礎。

本發明是基于上述現有技術，并針對現有技術的不足進行改進發明的。

發明內容

有鑒于此，本發明提供一種帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，該方法準確度高，精度高。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，所述方法為激光共聚焦法，將染色后的靶細胞置于激光共聚焦顯微鏡的適應波長的熒光通道中，所述染料方式可以為FITC-Annexin?V/DAPI雙染色，捕獲靶細胞中各部位的熒光強度數據，對靶細胞各部位熒光強度數據進行分析以判斷靶細胞中帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的存在。所述熒光通道為藍綠雙色熒光通道，所述適應波長是指：藍光的激發波長為488nm,在600nm波長以上觀察。綠光的激發波長為543nm,在600nm波長以上觀察。

進一步，所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，所述靶細胞為HL-60或急性早幼粒細胞白血病病人血中性粒細胞。進一步，所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，還設置有陰性對照組和/或空白對照組。主要是檢測HL-60細胞或病人血中性粒細胞中NLS-RARα的表達及定位，以K562細胞中野生型RARα的表達及定位作陰性對照。

進一步，所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，所述靶細胞被制成切片，具體為：取靶細胞涂片，并用多聚甲醛進行固定，再對靶細胞進行透膜處理，得切片。

進一步，所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，對靶細胞進行染色，具體為：用RARα特異性抗體與所述靶細胞結合，再用FITC-Annexin?V標記的熒光二抗孵育。

進一步，所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，所述RARα特異性抗體為兔抗人RARα的多克隆抗體；所述RARα特異性抗體和所述熒光二抗按1:200的體積比稀釋。

進一步，所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，在激光共聚焦法之前，還包括預實驗Ⅰ，所述預實驗為采用Western?blotting驗證HL-60細胞中的NE酶，中性白細胞彈性蛋白酶(Neutrophil?Elastase，NE)可將PML-RARα融合蛋白裂解成52KDa的PML(NLS-)和61KDa的NLS-RARα兩種變異蛋白。NE的這一特異性切割在APL的發生發展中起到了非常重要的作用。NE酶的檢測方式具體為：分別收集對數生長期的目的細胞和對照細胞，RIPA裂解后提取細胞總蛋白，定量稱取，進行SDS-PADE電泳，以半干轉膜法轉至PVDF膜上，封閉，加入兔抗人NE多抗，所述兔抗人NE多抗作1:500體積稀釋，進行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，然后洗膜，于暗室化學發光顯影成像判斷NE酶是否存在，以β-actin作為對照。