[發(fā)明專利]帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310370195.4
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN103412131B
• 公開（公告）日: 2017-02-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉北忠;王慧;鐘梁;朱新瑜;馬鵬鵬;胡秀秀;高遠(yuǎn)梅;張曦
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所11308
• 代理人: 秦力軍

1.帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，所述方法為激光共聚焦法，其特征在于：將經(jīng)染色后的靶細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡的適應(yīng)波長的雙色熒光通道中，捕獲靶細(xì)胞中各部位的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，對靶細(xì)胞各部位熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以判斷靶細(xì)胞中帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的存在。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：所述靶細(xì)胞為HL-60或急性早幼粒細(xì)胞病人血中性粒細(xì)胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：還設(shè)置有陰性對照組和/或空白對照組。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：所述靶細(xì)胞被制成涂片，具體為：取靶細(xì)胞涂片，并用多聚甲醛進(jìn)行固定，再對靶細(xì)胞進(jìn)行透膜處理，得涂片。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：對靶細(xì)胞進(jìn)行染色，具體為：用RARα特異性抗體與所述靶細(xì)胞結(jié)合，再用FITC-Annexin?V標(biāo)記的熒光二抗孵育。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：所述RARα特異性抗體為兔抗人RARα的多克隆抗體；所述RARα特異性抗體和所述熒光二抗按1:200的體積比稀釋。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：在激光共聚焦法之前，還包括預(yù)實(shí)驗(yàn)Ⅰ，所述預(yù)實(shí)驗(yàn)為采用Western?blotting驗(yàn)證HL-60細(xì)胞中的NE酶，具體為：

分別收集對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞，RIPA裂解后提取細(xì)胞總蛋白，定量稱取，進(jìn)行SDS-PADE電泳，以半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉，加入兔抗人NE多抗，所述兔抗人NE多抗作1:500體積稀釋，進(jìn)行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，然后洗膜，于暗室化學(xué)發(fā)光顯影成像判斷NE酶是否存在，以β-actin作為對照。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：

在激光共聚焦法之前，還包括預(yù)實(shí)驗(yàn)Ⅱ，所述預(yù)實(shí)驗(yàn)為采用Western?blotting驗(yàn)證帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白，具體為：分別收集對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞和K562細(xì)胞，分別提取胞核蛋白，定量稱取，進(jìn)行SDS-PADE電泳，以半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉，加入兔抗人RARα多抗，所述多抗作1:500體積稀釋，進(jìn)行洗膜，并加入羊抗兔二抗孵育，所述羊抗兔二抗作1:1000倍體積稀釋，然后洗膜，于暗室化學(xué)發(fā)光顯影成像判斷帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白是否存在，以Histone?H3作為對照。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：在激光共聚焦法同時(shí)，還包括平行實(shí)驗(yàn)，所述平行實(shí)驗(yàn)采用了細(xì)胞熒光免疫法，具體為：

A制備涂片

取靶細(xì)胞涂片，并用多聚甲醛進(jìn)行固定，再對靶細(xì)胞進(jìn)行透膜處理，得切片；

B熒光染色

對步驟A所得涂片封閉處理后，用RARα抗體與切片上的所述靶細(xì)胞共孵育，形成復(fù)合物，用熒光二抗與所述復(fù)合物孵育至充分結(jié)合，得熒光染色切片；

C熒光強(qiáng)度的獲取和分析

在熒光顯微鏡下掃描熒光染色涂片，每張所述切片選取熒光表達(dá)最強(qiáng)的視野觀察，視野數(shù)具有統(tǒng)計(jì)數(shù)意義，并由計(jì)算機(jī)掃描軟件分析結(jié)果;。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白的檢測方法，其特征在于：所述平行實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置有實(shí)驗(yàn)組、正常對照組；步驟C中，當(dāng)實(shí)驗(yàn)組切片的熒光強(qiáng)度平均值為正常對照組切片的熒光強(qiáng)度平均值的X倍及以上時(shí)，判定為所述靶細(xì)胞中存在帶核定位信號的維甲酸受體α蛋白;所述X為0.8600±0.04084除以0.2933±0.04726的值。