[發明專利]一種多藥耐藥肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及檢測方法

在審

• 申請號: 201310369232.X
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN104414771A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 季旭明
• 申請（專利權）人: 季旭明
• 主分類號: A61D7/00
• 分類號: A61D7/00;C12N5/09;G01N33/68;G01N21/84;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南魯科專利代理有限公司 37214
• 代理人: 周長義;崔民海

技術領域

?本發明涉及動物藥理實驗技術領域，特別涉及一種多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法及檢測方法。

背景技術

腫瘤的多藥耐藥（Multidrug?Resistance,MDR）是導致肺癌化療失敗的主要原因，也是肺癌治療急需解決的難題。據有關資料統計，在腫瘤年死亡率中，屬內在性多藥耐藥的約占61%,屬獲得性多藥耐藥的約占33%，即90%以上的腫瘤患者死因與耐藥有關。肺癌MDR形成機制很復雜，國內外對發生其進行了很多探索，因此，肺癌的多藥耐藥模型的建立很重要。無胸腺裸鼠（Nude，簡稱裸鼠）目前已成為醫學生物學研究領域中不可缺少的實驗動物模型。特別是在腫瘤學、免疫學、藥品與生物制品的安全性評價及有效藥品的篩選等實驗方面，它有著特殊的價值。裸鼠的先天性T淋巴細胞免疫缺陷及近交系的特點，極大地減少了個體差異，成為構建腫瘤模型較理想的載體。裸鼠移植瘤模型可以直接模擬人體內腫瘤的自然生長過程，且能夠觀察腫瘤與宿主的相互作用。同時長期傳代方便，成功率高，是一種研究腫瘤的重要方法。建立成功的裸鼠移植瘤模型，是進行藥物篩選的有利平臺。

發明內容

本發明的目的是建立耐藥性穩定的裸鼠肺腺癌移植瘤模型，為進行耐藥機制研究及逆轉藥物篩選提供人源化動物模型，并可進一步拓展應用于腫瘤類重大疾病的診斷、防治技術的轉化。本發明是這樣實現的；一種多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法：

a、首先進行細胞培養及鼠間接種傳代，人肺腺癌細胞株A549及耐藥細胞株A549/DDP，常規傳代培養，取對數生長期的細胞備用；

b、鼠間接種傳代，建立模型，雌性近交系裸小鼠，4～5周齡，體重15g～17g，在無特定病原體SPF級動物合格環境下飼養，自由攝取水分和食物，各實驗均在無菌超凈工作臺中進行，無菌條件下，取對數生長期腫瘤細胞A549及A549/DDP，制備細胞懸液，裸鼠右腋下接種0.2ml/只，建立第一代人肺腺癌細胞A549和耐藥株A549/DDP裸鼠移植瘤模型；待裸鼠皮下包塊長至約100mm³時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的A549、A549/DDP瘤塊，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基，抽樣證明沒有污染，制備瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種，建立第二代裸鼠模型；待裸鼠皮下包塊長至約100mm³時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的A549、A549/DDP瘤塊，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基，抽樣證明沒有污染，制備瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種，建立第三代裸鼠模型；鼠間傳代至3代，每代6只；用第4代裸鼠A549移植瘤組和A549/DDP移植瘤組進行成模性檢測。

按照上述的多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法建立的裸鼠肺癌多藥耐藥模型的檢測方法：

a、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤生長狀況觀察，第1～3代裸鼠均于移植后15±6天，即9-21天左右出瘤，至3周左右直徑可長至5mm，第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤成功率均為100%，平均潛伏期為7±1.35天，即5.65-8.35天；平均每天生長速度為102.23±31.66mm3，兩組瘤體積隨時間延長逐漸增大；

b、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤形態學觀察，肉眼觀察：觀察第4代移植瘤見瘤體呈局部結節樣生長，表面光滑，不易活動，收集移植瘤時見外觀呈黃白色，有血管生長分布，與周圍組織邊界清晰，無粘連，剖面呈粉紅色，中央偶有出血壞死或液化，光鏡檢查：鏡下移植瘤呈現中低分化的腺癌特征，A549/DDP移植瘤則多呈實性團塊狀，呈橢圓形或長梭形，核大深染，呈中度異形性，排列不整齊，核仁明顯。瘤細胞呈侵潤生長，壞死較少，間質有較多微血管形成；

?c、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤耐藥性檢測?，取裸鼠耐藥移植瘤，篩網法分離細胞，對原代細胞與移植瘤細胞進行IC₅₀檢測，原代A549細胞和A549/DDP細胞的IC₅₀分別為24.1μmol/L和335.2μmol/L；裸鼠A549/nude和A549/DDP/nude的IC₅₀分別為23.8μmol/L和321.4μmol/L，計算原代細胞和裸鼠移植瘤細胞的耐藥倍數，耐藥倍數＝耐藥細胞IC₅₀／親本細胞IC₅₀，分別為13.9和13.5，表明A549/DDP?移植瘤細胞和原代細胞對DDP的耐藥倍數無顯著差異，說明裸鼠移植癌耐藥性穩定；???