[發明專利]一種多藥耐藥肺癌裸鼠移植瘤模型的建立及檢測方法

在審

• 申請號: 201310369232.X
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN104414771A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發明（設計）人: 季旭明
• 申請（專利權）人: 季旭明
• 主分類號: A61D7/00
• 分類號: A61D7/00;C12N5/09;G01N33/68;G01N21/84;C12Q1/68
• 代理公司: 濟南魯科專利代理有限公司 37214
• 代理人: 周長義;崔民海

1.一種多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法，其特征在于：?

a、首先進行細胞培養及鼠間接種傳代，人肺腺癌細胞株A549及耐藥細胞株A549/DDP，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在37℃、5%CO₂條件下培養；A549/DDP細胞培養液中順鉑DDP的維持濃度為6μmol/L；常規傳代培養，取對數生長期的細胞備用；

b、鼠間接種傳代，建立模型，雌性近交系裸小鼠，4～5周齡，體重15g～17g，在無特定病原體SPF級動物合格環境下飼養，自由攝取水分和食物，各實驗均在無菌超凈工作臺中進行，無菌條件下，取對數生長期腫瘤細胞A549及A549/DDP，制備細胞懸液，濃度為5×10⁷個/ml，裸鼠右腋下接種0.2ml/只，建立第一代人肺腺癌細胞A549和耐藥株A549/DDP裸鼠移植瘤模型；待裸鼠皮下包塊長至約100mm³時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的A549、A549/DDP瘤塊，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基，抽樣證明沒有污染，制備瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種0.2ml/只，30min內完成，建立第二代裸鼠模型；待裸鼠皮下包塊長至約100mm³時，脫頸法處死裸鼠，無菌條件下，分別取完好的A549、A549/DDP瘤塊，置于玻璃研磨器中，加入RPMI-160培養基，抽樣證明沒有污染，制備瘤細胞懸液，進行細胞計數，裸鼠右腋下接種0.2ml/只，30min內完成，建立第三代裸鼠模型；鼠間傳代至3代，每代6只；用第4代裸鼠A549移植瘤組和A549/DDP移植瘤組進行成模性檢測。

2.一種按照權利要求1所述的多藥耐藥肺癌動物模型的建立方法建立的裸鼠肺癌多藥耐藥模型的檢測方法，其特征在于：

a、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤生長狀況觀察，第1～3代裸鼠均于移植后15±6天，即9-21天左右出瘤，至3周左右直徑可長至5mm，第4代A549/DDP裸鼠皮下移植瘤成功率均為100%，平均潛伏期為7±1.35天，即5.65-8.35天；平均每天生長速度為102.23±31.66mm3，兩組瘤體積隨時間延長逐漸增大；

b、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤形態學觀察，肉眼觀察：觀察第4代移植瘤見瘤體呈局部結節樣生長，表面光滑，不易活動，收集移植瘤時見外觀呈黃白色，有血管生長分布，與周圍組織邊界清晰，無粘連，剖面呈粉紅色，中央偶有出血壞死或液化，光鏡檢查：鏡下移植瘤呈現中低分化的腺癌特征，A549/DDP移植瘤則多呈實性團塊狀，呈橢圓形或長梭形，核大深染，呈中度異形性，排列不整齊，核仁明顯，瘤細胞呈侵潤生長，壞死較少，間質有較多微血管形成；?

c、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤耐藥性檢測?，取裸鼠耐藥移植瘤，篩網法分離細胞，對原代細胞與移植瘤細胞進行IC₅₀檢測，原代A549細胞和A549/DDP細胞的IC₅₀分別為24.1μmol/L和335.2μmol/L；裸鼠A549/nude和A549/DDP/nude的IC₅₀分別為23.8μmol/L和321.4μmol/L，計算原代細胞和裸鼠移植瘤細胞的耐藥倍數，耐藥倍數＝耐藥細胞IC₅₀／親本細胞IC₅₀，分別為13.9和13.5，表明A549/DDP?移植瘤細胞和原代細胞對DDP的耐藥倍數無顯著差異，說明裸鼠移植癌耐藥性穩定；

d、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥基因mdr1和多藥耐藥相關蛋白基因mrp信使核糖核酸?mRNA的半定量，逆轉錄-聚合酶鏈式擴增反應RT-PCR分析A549/DDP細胞裸鼠移植瘤中多藥耐藥基因mdr1和多藥耐藥相關蛋白基因mrp的相對表達量分別為：2.079±0.071、3.503±0.044，與A549裸鼠移植瘤相比，A549/DDP裸鼠移植瘤中多藥耐藥基因和多藥耐藥相關蛋白基因的?mRNA的相對表達量均顯著升高P＜0.01；提示在裸鼠耐藥移植瘤中耐藥基因表達比較高，維持其耐藥性；

e、肺癌多藥耐藥裸鼠移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達，多藥耐藥蛋白P-gp在細胞膜和細胞漿中表達，多藥耐藥相關蛋白MRP在細胞膜中表達；A549/DDP移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達呈強陽性，可見大量較大的棕黃色顆粒；統計學結果表明A549/DDP移植瘤多藥耐藥蛋白P-gp和多藥耐藥相關蛋白MRP表達水平均顯著高于A549移植瘤組P＜0.05。