[發(fā)明專利]ELISA檢測融合蛋白rMBP?NAP的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310368917.2
• 申請日: 2013-08-22
• 公開（公告）號: CN103558386B
• 公開（公告）日: 2017-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康巧珍;汲振余;劉鑫;李國棟;王婷;陳嬌;傅國
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學(xué)
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N21/31
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種融合蛋白rMBP-NAP，尤其涉及一種ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法。

背景技術(shù)

????幽門螺桿菌(Helicobacter?pylori，Hp)是定植于人胃粘膜的革蘭氏陰性螺桿菌，世界上約有50％的人感染幽門螺桿菌。幽門螺桿菌產(chǎn)生一系列獨(dú)特的毒力因子，其中包括中性粒細(xì)胞激活蛋白(Hp-NAP)。Hp菌體培養(yǎng)條件苛刻，難以進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。細(xì)菌抗原組分復(fù)雜，且含量較低，直接從全菌中分離純化出保護(hù)性抗原的難度較大，方法繁瑣。本實(shí)驗(yàn)室在中國第一個(gè)提交了HP-NAP的編碼基因序列，Gnebank登錄號AY366361，并構(gòu)建了由大腸桿菌E.?coli?TB1表達(dá)重組蛋白rMBP-NAP的方法，rMBP-NAP蛋白的分子量約為?59KD，為大分子蛋白抗原，該蛋白由MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）和NAP（幽門螺桿菌中性粒細(xì)胞激活蛋白）兩種蛋白融合而成，具體制備方法見專利CN201010177875.0。

????Enzyme-linkedimmunoassay，簡稱ELISA，是利用抗原抗體之間專一性鍵結(jié)之特性，對檢體進(jìn)行檢測，主要以夾心法(sandwich)、間接法(indirect)、以及競爭法(Competitive)三種為主。

????其中雙抗體夾心法基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體抗原酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的，因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在方法可檢測范圍內(nèi))。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個(gè)不同的抗原決定簇結(jié)合，則屬于雙位點(diǎn)夾心法。

????雙抗體夾心法中，傳統(tǒng)的雙多抗夾心法(A法)所需檢測抗體和固相載體包被抗體都是多抗，制備簡單，在一定范圍內(nèi)檢測靈敏度高，信號顯示強(qiáng)，很難避免鉤狀效應(yīng)，其主要問題在于：固相載體上的抗體和檢測抗體都為針對完整抗原所有抗原結(jié)合位點(diǎn)多克隆抗體，抗原濃度比較低的時(shí)候，固相支持物上的抗體幾乎跟抗原上所有位點(diǎn)結(jié)合，結(jié)合力強(qiáng)，空余位點(diǎn)少，檢測抗體與抗原位點(diǎn)少，結(jié)合力弱，只要固相支持物上的抗體未與抗原結(jié)合飽和，抗原量與最后信號顯示部呈線性關(guān)系；隨著抗原量的增加，固相支持物上的抗體與抗原結(jié)合飽和，空余位點(diǎn)越來越多，檢測抗體與抗原的空余位點(diǎn)結(jié)合，信號顯示與實(shí)際抗原增長呈幾何倍數(shù)增長，同樣不呈線性關(guān)系；隨著抗原量的增加，固相載體上的抗體與每個(gè)抗原的結(jié)合位點(diǎn)很少，結(jié)合力很弱，而過量的檢測抗體與其結(jié)合位點(diǎn)增多，結(jié)合力增強(qiáng)，因?yàn)榭乖贵w結(jié)合本來就是一個(gè)動態(tài)可逆的反應(yīng)過程，一旦從固相載體上抗體與抗原解離下來的時(shí)候，位點(diǎn)立即被檢測抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物沉淀，在洗滌過程中被洗掉，隨著抗原量的增加，而信號反而降低，就是所謂的鉤狀效應(yīng)。此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

而用高親和力的單克隆抗體對(B法)即檢測抗體和固相載體包被抗體都用單克隆抗體，生產(chǎn)此類試劑盒可削弱鉤狀效應(yīng)，由于固相載體上的抗體和檢測抗體結(jié)合的不是相同的位點(diǎn)，所以不形成競爭關(guān)系，一般情況下不會形成鉤狀效應(yīng)，但是單克隆抗體制備周期長，成本高，特別是高親和力的配對抗體更是不容易得到，同時(shí)，由于固相載體上抗體和檢測抗體都是單位點(diǎn)與抗原結(jié)合，所以結(jié)合力弱，信號顯示值低，敏感性差，穩(wěn)定性也不好。

發(fā)明內(nèi)容

????本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法,制備方法簡單、成本低、周期短，且精密度、特異性好。

????為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

????一種ELISA檢測融合蛋白rMBP-NAP的方法，包括以下步驟：

1）包被：將100ul被包被緩沖液稀釋至500ng/mL的兔抗幽門螺桿菌NAP多抗，包被至固體載體如酶標(biāo)板，用洗滌緩沖液洗滌；??

2）封閉：再加封閉液以封閉，孵育后洗滌

3）加樣：分別加入100ul工作濃度（15.625-1000ng/mL、2倍倍比稀釋的梯度）的rMBP-NAP抗原標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，孵育后洗滌