[發明專利]改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法

有效

• 申請號: 201310366833.5
• 申請日: 2013-08-21
• 公開（公告）號: CN103898090A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 劉子記;朱婕;曹振木;楊衍;牛玉;詹園鳳
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法，具體涉及利用正交設計優化黃燈籠辣椒基因組DNA提取中幾個重要成分的濃度，旨在篩選出一種可獲得高質量DNA分子的提取方法。

背景技術

海南黃燈籠椒(Capsicum?chinense?Jacquin)為茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum)多年生草本植物，起源于南美亞馬遜流域，又稱黃辣椒、黃帝椒等，植物分類學上屬于中國辣椒(Capsicum?chinense)，是海南特有的地方珍稀辣椒品種，在海南有著悠久的栽培和食用歷史，主要分布于海南島東南、西南沿海地區，喜高溫、強光，生長勢強，枝葉茂盛，成熟果實黃色或金黃色，形狀似燈籠，含有豐富的維生素C、胡蘿卜素、礦物質、氨基酸及微量元素。另外，海南黃燈籠椒含有豐富的辣椒素類物質，具有極強的辣味，其鮮果辣度17萬SHU左右，同時還含有其它芳香類物質，是加工辣椒醬和提取辣椒素的最佳原料之一，黃燈籠椒辣椒醬已成為海南知名的旅游產品，深受國內外消費者的歡迎，辣椒素的藥理活性作用被世界各國廣泛重視，能抑制胃酸分泌，刺激堿性粘液分泌，有助于預防和治療胃潰瘍；能加速能量和脂類的新陳代謝，減少體內脂肪積累；可阻止有關細胞的新陳代謝，降低癌癥細胞的發生率。總之，海南黃燈籠椒具有極高的經濟價值、營養價值和藥用價值，在飲食和醫藥產品上應用廣泛，是海南最具開發潛力的特色蔬菜作物。

基因組DNA提取是分子生物學研究的基礎。常用的DNA提取方法主要有十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)法、十二烷基硫酸鈉(SDS)法和高鹽低pH法。SDS法操作簡單，但所得產物含雜質較多；CTAB可破碎細胞壁和細胞膜，并能與核酸形成復合物，進而從富含多酚和多糖的植物組織中分離出高質量基因組DNA；高鹽pH法提取DNA產率較低，且會殘留較多的小分子物質。由于不同材料所含的物質成分及各種成分的含量差異較大，因此，對于不同植物基因組DNA提取應采取不同的方法。

高質量的DNA是進行遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜構建和分子標記輔助選擇的前提，是實驗結果可靠性和重復性好的保證。模板質量將直接影響PCR擴增反應。酚類物質和多糖是影響植物基因組DNA提取的2個重要因素，常導致DNA分子降解，嚴重影響DNA純度和產量。黃燈籠辣椒葉片富含糖類、蛋白質和酚類等物質，酚類物質容易發生氧化，與DNA結合形成黃色或黑褐色沉淀，難以溶解，DNA純度較低，難以滿足黃燈籠辣椒分子生物學研究需求。有效去除多糖、蛋白質和酚類物質等，是提取高質量DNA分子的關鍵。目前有效去除植物多糖、酚類物質的DNA提取方法主要有兩種：一種是CsCl密度梯度離心法；一種是CTAB法，前者儀器設備要求較高，費時間，成本高；后者操作較為簡單，適用于大多數植物DNA提取，應用日趨廣泛。因此，需要采用改良的CTAB法優化黃燈籠辣椒基因組DNA的提取，快速、經濟、安全、高效地提取黃燈籠辣椒基因組DNA分子。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為清潔劑，具有吸附作用，能吸附多糖將其除去。二硫蘇糖醇(DTT)是一種還原劑，有抗氧化作用，能有效的防止酚類氧化成醌，避免了DNA褐變的發生，但DTT的刺激性氣味要小，毒性也比巰基乙醇低很多。用改良的CTAB法優化黃燈籠辣椒基因組DNA提取中幾個重要成分(CTAB、PVP和DTT)的濃度，有助于篩選出可獲得高質量DNA分子的提取方法，為進一步開展黃燈籠辣椒分子生物學研究奠定基礎。

發明內容

本發明目的是針對黃燈籠辣椒葉片中富含酚類、糖類和蛋白的特點，利用正交設計優化黃燈籠辣椒基因組DNA提取中幾個重要成分的濃度，篩選出一種可獲得高質量DNA分子的提取方法，解決常規方法提取的DNA分子雜質較多、產率較低、易降解、易褐變、所用試劑毒性較大，如文獻(向珣，宋小麗，施倩倩.DNA-AFLP分析用辣椒基因組DNA提取方法的優化.長江大學學報，2009，6(2)：48-51)，影響下一步分子生物學研究的難題。

本發明的技術方案如下：

改良的黃燈籠辣椒葉片基因組DNA提取方法，包括以下步驟：

(1)配制CTAB-3提取液，高溫滅菌后，65℃預熱；CTAB-3提取液為：0.1mol?L^-1Tris?pH7.5，0.05mol?L^-1EDTApH8.0，0.7mol?L^-1NaCl，2％CTAB，0.5％PVP，0.2％DDT；其中，百分比為質量百分比濃度；