[發明專利]一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法

有效

• 申請號: 201310366716.9
• 申請日: 2013-08-21
• 公開（公告）號: CN103436512A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 邊斐;畢玉平;彭振英;馬德源;楊連群;范仲學;陳高
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12N9/66
• 分類號: C12N9/66;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 宋玉霞

技術領域

本發明涉及基因工程方法提高酶活力技術領域，特別是涉及一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法。?

背景技術

蛋白酶（peptidase,?proteases,?proteinases或proteolytic?enzymes）是一類可催化蛋白質或肽類肽鍵水解的酶類。

彈性蛋白（elastin）在動物組織中廣泛存在，如富有彈性的組織、肺、大動脈、某些韌帶、皮膚及耳部軟骨等。彈性蛋白由多條彈性蛋白原（tropoelastin）多肽鏈以共價交聯方式連接而成（Yeo?et?al.,?2011），具有非常穩定的結構，而且不含常見蛋白酶識別的氨基酸和酶切位點，使得彈性蛋白只能被彈性蛋白酶分解。能夠水解彈性蛋白的蛋白酶稱為彈性蛋白酶（elastase）。

按照來源分，彈性蛋白酶可分為微生物彈性蛋白酶和動物彈性蛋白酶。其中，哺乳動物彈性蛋白酶主要存在于動物的胰腺和吞噬細胞中（Horwitz?et?al.,?1999;?Mason?et?al.,?1986;?Bode?et?al.,?1989;?Antonicelli?et?al.,?2007）。研究比較多的細菌來源的彈性蛋白酶有金屬蛋白酶M4家族的PAE/pseudolysin?(Morihara?and?Homma,1985)和vibriolysin（Lutfullah?et?al.,?2008）、M9家族的MAP1?peptidase(Dumont?et?al.,?1994)、M12家族的myroilysin(Chen?et?al.,?2009a)、M23家族的staphylolysin（Kessler?and?Ohman,?2004b）和絲氨酸蛋白酶S8家族的A1p1（Behnsen?et?al.,?2010）等。

彈性蛋白酶在醫學、食品學和日用化學上有著廣泛應用。在醫藥方面主要作為治療藥物：（1）治療高脂血癥，（2）防治動脈粥樣硬化，（3）抑制脂肪肝發展，（4）治療慢性氣管炎及其它結締組織纖維增生性疾病，（5）外用于消除皮膚焦痂、碎屑，用于燒傷患者的治療以及皮膚潰瘍、口腔潰瘍等癥。在食品工業方面常用于對動物難以處理和食用的韌帶、大動脈血管、筋腱等蛋白質廢料進行加工。日用化學工業方面，彈性蛋白酶主要用于療效化妝品的生產。

PAE?（Pseudomonas?aeruginosa?Elastase,?pseudolysin）是革蘭氏陰性機會致病菌銅綠假單孢菌（Pseudomonas?aeruginosa,?PA）分泌的一種胞外彈性蛋白酶，可以降解酪蛋白、血紅蛋白、卵清蛋白、纖維蛋白等。在底物特異性方面，PAE傾向降解P1’位為疏水或芳香族氨基酸的肽鍵（Morihara?1995;?Morihara?et?al.,?1965）。目前，已經商品化的PA來源的PAE售價昂貴，EPC公司（Elastin?Products?Company?Inc.）每0.1?mg?PAE售價183美元（PE961，https://www.elastin.com/storefront/tabid/58/c/Metalloproteinases/CategoryID/19/Default.aspx），Merck公司每0.1mg?PAE售價4500元人民幣（324676-100UG，http://www.millipore.com/catalogue/item/324676-100ug）。PAE能夠在原核細胞和真核細胞中異源表達并且重組酶有酶活（Ogino,H.?et?al.,?2000;?Lin?et?al.,?2009）。我們前期研究表明將構建好的含lasB基因的表達載體轉化至E.coli?BL21(DE3)中，?1?L培養物細胞經超聲破碎和柱層析純化后，可獲得純酶4.5?mg，總酶活285984個酶活單位（酶活力定義為60???C，每分鐘催化酪蛋白水解生成1?μg?酪氨酸的酶量為1個單位U）（Xie?et?al.,?2009）。