[發明專利]一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法

有效

• 申請號: 201310366716.9
• 申請日: 2013-08-21
• 公開（公告）號: CN103436512A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 邊斐;畢玉平;彭振英;馬德源;楊連群;范仲學;陳高
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院生物技術研究中心
• 主分類號: C12N9/66
• 分類號: C12N9/66;C12N15/57;C12N15/70
• 代理公司: 濟南舜源專利事務所有限公司 37205
• 代理人: 宋玉霞

1.一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法，其特征在于，PAE中殘基正負電荷間距離小于4???，不考慮His形成的鹽鍵之外含有6個鹽鍵，鹽鍵1-3位于催化腔附近，鹽鍵4-6位于C端結構域的C末端，將形成鹽鍵2的Asp189-Arg179中的Asp189進行定點突變，提高PAE比活力。

2.?根據權利要求1所述的一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法，其特征在于，將形成鹽鍵2的Asp189-Arg179中的Asp189定點突變為Ala，構建突變體D189A。

3.?根據權利要求2所述的一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法，其特征在于，突變體D189A的引物：

兩端引物：

正向引物：GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC，劃橫線部分表示Nde?I酶切位點；

反向引物：CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG，劃橫線部分表示Xho?I酶切位點；

D189A中間引物：

3’?端引物：TTCCTGATCGGCTACGCGATCAAGAAGGGCAGCG

5’?端引物：GCCCTTCTTGATCGCGTAGCCGATCAGGAAGTCGTTC。

4.根據權利要求3所述的一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法，其特征在于，突變體的原核表達為：

①以含Nde?I酶切位點的正向引物和突變體中間引物的3’引物為兩端引物，以lasB質粒為模板，擴增產物標為Ⅰ；以含Xho?I酶切位點的反向引物和突變體中間引物的5’引物為兩端引物，以lasB質粒為模板，擴增產物標為Ⅱ；

②回收Ⅰ和Ⅱ，通過PCR?反應程序，將Ⅰ基因和Ⅱ?基因相互融合；

③最后再加入兩側正、反向引物通過PCR反應程序，得到突變體基因。

5.?根據權利要求4所述的一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法，其特征在于，有酶活突變體的篩選：

①利用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，EB染色，切取目的片段大小的DNA，回收DNA；

②DNA用限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切，連接同樣酶切過的pET-22b表達載體；

③連接產物轉化E.?coli?DH5α；

④從轉化平板上挑取轉化子至液體LB培養基中培養，利用提質粒酶切驗證的方法篩選攜帶目的基因的轉化子；

⑤將測序正確的含目的基因的質粒轉化E.?coli?BL21(DE3)；

⑥從平板上挑取轉化子單菌落到試管中，37??C?過夜培養后按1%接種量轉接到三角瓶中，37??C?培養至OD₆₀₀?＝1.0?左右加入終濃度1?mM?的IPTG?繼續培養過夜；

⑦發酵液離心收集菌體，菌體用三蒸水洗滌3遍以上后用50?mM,pH?8.0的Tris-HCl?緩沖液重懸，超聲破碎至菌液澄清，超聲完畢后離心，上清在30??C?保溫2?h；

⑧用Folin－酚法測粗酶液酶活。

6.?根據權利要求5所述的一種通過缺失單個鹽鍵來提高PAE比活力的方法，其特征在于，步驟⑦發酵液離心收集菌體，超聲破碎條件為：功率300?w，超聲5?s，間隔10?s，超聲10?次。