[發(fā)明專利]一種檢測(cè)雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶活性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310366700.8
• 申請(qǐng)日: 2013-08-21
• 公開（公告）號(hào): CN103409496A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳玲;王小麗;繆冶煉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京醫(yī)科大學(xué);繆冶煉
• 主分類號(hào): C12Q1/48
• 分類號(hào): C12Q1/48
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務(wù)所 32230
• 代理人: 徐蓓

1.一種檢測(cè)雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶SULT1E1活性的方法，利用同位素標(biāo)記反應(yīng)底物和/或硫供體，所述反應(yīng)底物和硫供體在含有SULT1E1的待測(cè)樣品的催化作用下發(fā)生硫化反應(yīng)，通過對(duì)反應(yīng)得到的硫化底物進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出SULT1E1的活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述的反應(yīng)底物選自雌激素或甲狀腺激素；所述雌激素為雌二醇、雌酮或雌三醇；所述甲狀腺激素為甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸或四碘甲腺原氨酸。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的硫供體為5'-磷酸磺基-3'-磷酸腺苷或5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述的待測(cè)樣品為血漿。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：所述的待測(cè)樣品為組織提取物，所述的組織提取物為胎盤、卵巢、乳腺、子宮和/或血管內(nèi)皮細(xì)胞組織標(biāo)本。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于：用液體閃爍計(jì)數(shù)儀對(duì)硫化反應(yīng)得到的硫化底物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)同位素測(cè)試結(jié)果計(jì)算出待測(cè)樣品中SULT1E1的活性。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：用[³H]標(biāo)記-雌二醇（[³H]-E2）或[¹³¹I]標(biāo)記三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺原氨酸（[¹³¹I]-T3/T4）作為反應(yīng)底物，用5'-磷酸磺基-3'-磷酸腺苷（PAPS）或5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷作為硫供體提供硫酸基團(tuán)，添加含有SULT1E1的待測(cè)樣品，反應(yīng)后產(chǎn)生的[³H]-17β雌二醇-3硫酸鹽結(jié)合體（[³H]-E2-S）或[¹³¹I]-三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺原氨酸的硫化物（[¹³¹I]-T3/T4-S）用液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出待測(cè)樣品中SULT1E1的活性，所述的待測(cè)樣品為組織提取物或血漿，優(yōu)選為血漿。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：用[³H]-E2或[¹³¹I]-T3/T4作為反應(yīng)底物，添加含有內(nèi)源性SULT1E1和PAPS的待測(cè)樣品，反應(yīng)后產(chǎn)生[³H]-E2-S或[¹³¹I]-T3/T4-S用液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出待測(cè)樣品的SULT1E1活性，所述的待測(cè)樣品為組織提取物，優(yōu)選為胎盤、卵巢、乳腺或子宮組織標(biāo)本。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：用[³⁵S]標(biāo)記的PAPS（[³⁵S]-PAPS）提供硫酸基團(tuán)，用雌二醇或三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺原氨酸作為反應(yīng)底物，添加含有SULT1E1的待測(cè)樣品，反應(yīng)后產(chǎn)生[³⁵S]-17β雌二醇-硫酸鹽結(jié)合體（[³⁵S]-E2-S）或[³⁵S]-三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺原氨酸的硫化物（[³⁵S]-T3/T4-S）用液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算出中待測(cè)樣品中SULT1E1的活性，所述的待測(cè)樣品為組織提取物或血漿，優(yōu)選為血漿。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：（1）待測(cè)樣本處理：在非妊娠成年雌鼠和妊娠第15-18天的雌鼠，采血1毫升（抗凝），4℃離心（3500rpm）后取上清；用BCA法測(cè)量上清蛋白濃度；（2）反應(yīng)體系（0.5毫升）：[³H]-E2（0.25～10nM）、血漿蛋白（100～1600微克）、PAPS（10～1000μM）、DTT8mM、Tris-Cl?pH7.4，100mM、MgCl₂10mM；37℃反應(yīng)45分鐘，加入1.5毫升的冰三氯乙酸或冰甲醇停止反應(yīng)，震蕩混勻；加入1毫升二氯甲烷或氯仿抽提，4℃離心（12000rpm）后取上清0.2毫升；（3）用液體閃爍計(jì)數(shù)儀檢測(cè)[³H]-E2-S，計(jì)算出待測(cè)樣本中SULT1E1的活性。