[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因作物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310365343.3
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN103454424A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柴同杰;王新桐
• 申請（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;C07K16/40;C07K16/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種轉(zhuǎn)基因作物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT?Ⅱ)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法。?

背景技術(shù)

自1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物問世以來，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來一場新的革命。它克服了傳統(tǒng)育種的局限性，打破了物種間遺傳壁壘，加快了種質(zhì)改良進(jìn)程，取得顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積持續(xù)擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因作物的品種也在不斷增加。?

但轉(zhuǎn)基因生物安全，尤其是含有抗生素基因的轉(zhuǎn)基因作物的安全問題逐漸成為各國政府、科學(xué)界和社會(huì)公眾關(guān)注的焦點(diǎn)。盡管現(xiàn)在的一些研究表明卡那霉素抗性基因是安全的，但有研究表明在葉圍土壤中發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了與NPT?II基因序列同源性100％陽性片段，而認(rèn)為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中的NPT?II能夠向葉圍細(xì)菌漂移，所以尚不能對此下結(jié)論。而且世界上首例釋放上市的轉(zhuǎn)基因植物距今時(shí)間并不長，考慮到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)的出現(xiàn)具有長期的滯后性，其長期效應(yīng)如何、風(fēng)險(xiǎn)性可能有多大等問題目前還無法得出最終的結(jié)論，有必要對其進(jìn)行長期的跟蹤監(jiān)測。?

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明建立了靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性良好、操作簡單、快速的轉(zhuǎn)基因作物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法，該方法速度快、高通量，能大大縮短檢測周期，為轉(zhuǎn)基因植物的檢測提供保障，并能避免檢測過程中可能造成的生物污染。?

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：?

轉(zhuǎn)基因作物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT?Ⅱ)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法，包括如下步驟：?

(1)NPTⅡ基因的克隆與表達(dá)；?

(2)抗NPTⅡ蛋白單克隆抗體的制備；?

(3)抗NPTⅡ蛋白多克隆抗體的制備；?

(4)雙抗體夾心ELISA方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；?

通過方陣滴定實(shí)驗(yàn)確定包被抗體的最佳包被濃度和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋濃度并對ELISA條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化，最終確定如下體系：?

①用0.1M碳酸鹽緩沖液作為抗原包被液將兔多抗體稀釋至1：2000；100μL／孔包被ELISA板，4℃過夜；?

②用含0.05％Tween20的PBST洗滌液洗滌3次，每孔加入含5％脫脂奶粉的PBST溶液封閉液200μL，37℃封閉1h；?

③用PBST洗滌液洗滌3次后加入待檢樣品，100μL／孔，同時(shí)用陰性血清作對照，37℃反應(yīng)1h；?

④3次洗滌后加入100μL單抗(1：2500)，37℃反應(yīng)1h；?

⑤用PBST洗滌3次，加入1：5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG，?37℃反應(yīng)1h，PBST洗滌3次，最后加入100μL可溶性TMB底物顯色液，室溫條件避光反應(yīng)20min，用2M?H₂SO₄終止反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀在450nm下測定吸光值，以抗原濃度為橫坐標(biāo)，以A／A₀(A為標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度，A₀為陰性對照吸光度)值為縱坐標(biāo)，繪制曲線圖，根據(jù)曲線圖最佳線性范圍，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣品中NPTII蛋白濃度。?

所述抗NPTⅡ蛋白單克隆抗體的制備方法為：?

①選擇與骨髓瘤細(xì)胞Sp2／0同源的4-6周齡純系雌性BALB／c小鼠作為免疫動(dòng)物；?

免疫方案：初次免疫為100μg純化后的NPTⅡ蛋白與等體積弗式完全佐劑乳化完全，小鼠背部皮下多點(diǎn)注射；3周和6周后，取100μg?NPTⅡ蛋白與等體積弗式不完全佐劑乳化完全，背部皮下多點(diǎn)注射作為第二、三次免疫；融合前四天，腹腔注射100μg不加佐劑的NPTⅡ蛋白，為加強(qiáng)免疫；?

②加強(qiáng)免疫4天后，取小鼠脾細(xì)胞與Sp2／0骨髓瘤細(xì)胞利用PEG1500進(jìn)行化學(xué)法融合，間接ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)板上的陽性孔，經(jīng)過三次亞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并及時(shí)凍存穩(wěn)定分泌抗NPTⅡ蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，并利用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒確定單克隆抗體的亞型；Western-blot驗(yàn)證單克隆抗體的特異性；?

③選擇6—8周齡雌性BALB／c小鼠，腹腔注射弗式不完全佐劑0.5mL／只，一周后注射雜交瘤細(xì)胞0.5—1×10⁶個(gè)／只，7—10天后收集腹水，300×g離心取上清，經(jīng)間接ELISA方法檢測腹水效價(jià)；腹水經(jīng)?正辛酸-硫酸銨方法純化后，SDS-PAGE檢測純化效果。?

所述抗NPTII蛋白多克隆抗體的制備方法為；?