[發明專利]轉基因作物中新霉素磷酸轉移酶(NPTⅡ)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法

有效

• 申請號: 201310365343.3
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103454424A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 柴同杰;王新桐
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;C07K16/40;C07K16/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.轉基因作物中新霉素磷酸轉移酶(NPT?II)雙抗體夾心ELISA定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)NPTII基因的克隆與表達；

(2)抗NPTII蛋白單克隆抗體的制備；

(3)抗NPTII蛋白多克隆抗體的制備；

(4)雙抗體夾心ELISA方法及標準曲線的建立；

通過方陣滴定實驗確定包被抗體的最佳包被濃度和酶標抗體的最佳稀釋濃度并對ELISA條件進行摸索和優化，最終確定如下體系：

①用0.1M的碳酸鹽緩沖液作為抗原包被液將兔多抗體稀釋至1：2000；100μL／孔包被ELISA板，4℃過夜；

②用含0.05％Tween20的PBST溶液洗滌3次，每孔加入含5％脫脂奶粉的PBST溶液封閉液200μL，37℃封閉1h；

③用PBST洗滌液洗滌3次后加入待檢樣品，100μL／孔，同時用陰性血清作對照，37℃反應1h；

④3次洗滌后加入100μL單抗(1：2500)，37℃反應1h；

⑤用PBST洗滌3次，加入1：5000稀釋的HRP標記的兔抗鼠IgG，37℃反應1h，PBST洗滌3次，最后加入100μL可溶性TMB底物顯色液，室溫條件避光反應20min，用2M?H₂SO₄終止反應，利用酶標儀在450nm下測定吸光值，以抗原濃度為橫坐標，以A／A₀(A為標準蛋白吸光度，A₀為陰性對照吸光度)值為縱坐標，繪制曲線圖，根據曲線圖最佳線性范圍，建立標準曲線，通過標準曲線計算待測樣品中NPTII蛋白濃度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗NPTII蛋白單克隆抗體的制備方法為：

①選擇與骨髓瘤細胞Sp2／0同源的4—6周齡純系雌性BALB／c小鼠作為免疫動物；

免疫方案：初次免疫為100μg純化后的NPTII蛋白與等體積弗式完全佐劑乳化完全，小鼠背部皮下多點注射；3周和6周后，取100μg?NPTII蛋白與等體積弗式不完全佐劑乳化完全，背部皮下多點注射作為第二、三次免疫；融合前四天，腹腔注射100μg不加佐劑的NPTII蛋白，為加強免疫；

②加強免疫4天后，取小鼠脾細胞與Sp2／0骨髓瘤細胞利用PEG1500進行化學法融合，間接ELISA方法檢測細胞培養板上的陽性孔，經過三次亞克隆，擴大培養并及時凍存穩定分泌抗NPTII蛋白的雜交瘤細胞株，并利用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒確定單克隆抗體的亞型；Western-blot驗證單克隆抗體的特異性；

③選擇6—8周齡雌性BALB／c小鼠，腹腔注射弗式不完全佐劑0.5mL／只，一周后注射雜交瘤細胞0.5—1×10⁶個／只，7—10天后收集腹水，300×g離心取上清，經間接ELISA方法檢測腹水效價；腹水經正辛酸-硫酸銨方法純化后，SDS-PAGE檢測純化效果。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗NPTII蛋白多克隆抗體的制備方法為；

選擇6只體重約2kg的健康新西蘭大耳白兔作為免疫動物，在動物房觀察飼養一周；初次免疫采用2mL濃度為1mg／mL的免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合并充分乳化，大腿肌肉注射；以后換用弗氏不完全佐劑，每隔2周加強免疫一次，頸背部皮下多點注射；從第3次免疫后開始，每次免疫后7天左右，用1mL無菌注射器從耳邊緣靜脈取血0.5mL左右，間接ELISA法測定血清效價；當抗血清達到所需的效價時，最后一次加強免疫后7—10天，在無菌狀態下頸動脈采全血；于室溫下靜置2h，再置4℃冰箱中過夜使之充分收凝，300×g離心取血清，經正辛酸-硫酸銨方法純化后，SDS—PAGE檢測純化效果；

4.根據1-3任一權利要求所述的方法，其特征在于，所述轉基因植物為轉基因棉花或木瓜。