[發(fā)明專利]一種基于腺病毒AdC7的表達載體及其構(gòu)建方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310364528.2
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103923943B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周東明;成濤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明涉及一種基于腺病毒AdC7的表達載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明人設(shè)計了一種有效的策略，成功地基于黑猩猩型腺病毒AdC7構(gòu)建成一種新型表達載體。所述的疫苗載體可應(yīng)用于制備可高效表達且具有良好免疫原性的病毒疫苗。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和病毒學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種基于腺病毒AdC7的表達載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

重組腺病毒載體具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、表達水平高、持續(xù)時間長、易于純化等特點，并且免疫后可誘導(dǎo)外源基因特異性的細胞免疫與體液免疫反應(yīng)，因此是一種理想的疫苗載體。基于腺病毒人血清型2型(AdHu2)與5型(AdHu5)的表達載體在疫苗研究以及基因治療中曾被廣泛應(yīng)用，但由于人群中40-60%的個體已經(jīng)感染相應(yīng)的腺病毒，存在相應(yīng)的預(yù)存中和抗體，從而限制AdHu2和AdHu5載體的臨床應(yīng)用。為克服預(yù)存中和抗體的影響，一種方法是改造AdHu2和AdHu5載體的衣殼蛋白。一些研究顯示，可通過交換纖維蛋白基因來實現(xiàn)這一想法。但是這種嵌合病毒仍會被針對hexon表位的抗體所中和，而且一些hexon蛋白經(jīng)改造后的嵌合病毒不穩(wěn)定；另一種方法是選擇人稀有血清型或來源于其它動物宿主的腺病毒作為表達載體。由于人群中一般不會含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗體，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗載體，其免疫效果顯著優(yōu)于以人血清型腺病毒構(gòu)建的疫苗載體。目前，基于黑猩猩型腺病毒的新型疫苗載體成為疫苗研發(fā)中重要選擇。2013年5月，比爾蓋茲基金會(Bill&Melinda Gates Foundation)資助美國、英國以及瑞士的研究單位(公司)2900萬美元，用于新型黑猩猩腺病毒載體的研發(fā)。

構(gòu)建重組腺病毒載體的方法有三種。傳統(tǒng)的方法是在包裝細胞系中進行外源基因和野生型病毒的同源重組，從而獲得重組腺病毒，但這種方法操作復(fù)雜，費時費力，不容易獲得單一的重組腺病毒；第二種方法是基于在大腸桿菌中同源重組，其缺點是相對費時，容易發(fā)生突變。第三種方法是將腺病毒基因組直接克隆到質(zhì)粒載體上，然后線性化轉(zhuǎn)染包裝細胞系，拯救出腺病毒。由于腺病毒基因組相對較大，大小約為36kb，對其基因組進行直接克隆存在一定難度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種基于腺病毒AdC7的表達載體及其構(gòu)建方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備腺病毒表達載體的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC7基因組(較佳地，序列如GenBank登錄號AY530878.1)為基礎(chǔ)，刪除部分E1編碼區(qū)與全部E3編碼區(qū)，在E1刪除區(qū)增添I-Ceu I與PI-Sce I酶切位點，在E3刪除區(qū)增添RsrII酶切位點，獲得復(fù)制缺陷型的重組腺病毒表達載體。

在一個優(yōu)選例中，所述的刪除部分E1編碼區(qū)是指刪除野生型AdC7基因組中第458-3026位(基于GenBank登錄號AY530878.1的序列計算序列位點)的序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的刪除全部E3編碼區(qū)是指刪除野生型AdC7基因組中第27094-31799位(基于GenBank登錄號AY530878.1的序列計算序列位點)的序列。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括：

(1)將來源于pNEB193的origin序列、來源于AdC7腺病毒基因組的LITR片段、來源于AdC7腺病毒基因組的Nde I-Age I片段通過融合PCR融合成片段OLN，用Spe I與Age I酶切片段OLN；用Nde I、Age I與Spe I酶切AdC7腺病毒基因組，將切下的片段Age(4028)-SpeI(10610)(基于GenBank登錄號AY530878.1的序列計算序列位點)與已酶切過的片段OLN相連接形成質(zhì)粒pOIN；

(2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因組，將切下的目的片段Hind III(7153)-Avr II(23363)插入到質(zhì)粒pOIN的Hind III和Avr II位點中，獲得的質(zhì)粒命名為pOINH(基于GenBank登錄號AY530878.1的序列計算序列位點)；