[發明專利]一種基于腺病毒AdC7的表達載體及其構建方法

有效

• 申請號: 201310364528.2
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103923943B
• 公開（公告）日: 2019-01-22
• 發明（設計）人: 周東明;成濤
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

1.一種制備腺病毒表達載體的方法，其特征在于，所述方法包括：

以GenBank登錄號AY530878.1所示的野生型腺病毒AdC7基因組為基礎，刪除部分E1編碼區與全部E3編碼區，在E1刪除區增添I-Ceu I與PI-Sce I酶切位點，在E3刪除區增添RsrII酶切位點，獲得復制缺陷型的重組腺病毒表達載體；

其中，所述的刪除部分E1編碼區是指刪除野生型AdC7基因組中第458-3026位的序列；所述的刪除全部E3編碼區是指刪除野生型AdC7基因組中第27094-31799位的序列；

其中，所述的方法包括：

(1)將SEQ ID NO:1中第1-1882位所示的origin序列、來源于AdC7腺病毒基因組的LITR片段、來源于AdC7腺病毒基因組的Nde I-Age I片段通過融合PCR融合成片段OLN，用Spe I與Age I酶切片段OLN；用Nde I、Age I與Spe I酶切AdC7腺病毒基因組，將切下的片段Age-SpeI與已酶切過的片段OLN相連接形成質粒pOIN；

(2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因組，將切下的目的片段Hind III-Avr II插入到質粒pOIN的Hind III和Avr II位點中，獲得的質粒命名為pOINH；

(3)從AdC7腺病毒基因組中擴增位于AdC7腺病毒基因中31800-36535之間的片段，在5’端引入Avr II與Rsr II酶切位點，在3’端引入Pac I與Asis I位點，將擴增的片段插入到pOINH的Avr II與Asis I位點中，獲得的質粒命名為pOINHR；和

(4)從AdC7腺病毒基因組中擴增位于AdC7腺病毒基因中23165-27093之間的片段，在3’端引入Rsr II位點，將擴增的片段插入到pOINHR的Avr II與Rsr II位點中，獲得復制缺陷型的重組腺病毒表達載體。

2.一種腺病毒表達載體，其特征在于，所述表達載體在GenBank登錄號AY530878.1所示的野生型腺病毒AdC7基因組基礎上刪除部分E1編碼區與全部E3編碼區，并且，在E1刪除區增添I-Ceu I與PI-Sce I酶切位點，在E3刪除區增添Rsr II酶切位點；

其中，所述的刪除部分E1編碼區是指刪除野生型AdC7基因組中第458-3026位的序列；所述的刪除全部E3編碼區是指刪除野生型AdC7基因組中第27094-31799位的序列；

所述腺病毒表達載體通過以下方法制備：

(1)將SEQ ID NO:1中第1-1882位所示的origin序列、來源于AdC7腺病毒基因組的LITR片段、來源于AdC7腺病毒基因組的Nde I-Age I片段通過融合PCR融合成片段OLN，用Spe I與Age I酶切片段OLN；用Nde I、Age I與Spe I酶切AdC7腺病毒基因組，將切下的片段Age-SpeI與已酶切過的片段OLN相連接形成質粒pOIN；

(2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因組，將切下的目的片段Hind III-Avr II插入到質粒pOIN的Hind III和Avr II位點中，獲得的質粒命名為pOINH；

(3)從AdC7腺病毒基因組中擴增位于AdC7腺病毒基因中31800-36535之間的片段，在5’端引入Avr II與Rsr II酶切位點，在3’端引入Pac I與Asis I位點，將擴增的片段插入到pOINH的Avr II與Asis I位點中，獲得的質粒命名為pOINHR；和

(4)從AdC7腺病毒基因組中擴增位于AdC7腺病毒基因中23165-27093之間的片段，在3’端引入Rsr II位點，將擴增的片段插入到pOINHR的Avr II與Rsr II位點中，獲得復制缺陷型的重組腺病毒表達載體。

3.如權利要求2所述的腺病毒表達載體，其特征在于，所述表達載體的酶切位點PI-SceI和I-Ceu I之間，還包括外源的抗原編碼基因。

4.如權利要求3所述的腺病毒表達載體，其特征在于，所述的外源抗原是流感病毒的血凝素抗原。