[發明專利]應用于小麥成熟胚培養的干胚游離方法

有效

• 申請號: 201310364141.7
• 申請日: 2013-08-19
• 公開（公告）號: CN103436484A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發明（設計）人: 解超杰;孫其信;倪中福;梁榮奇;李映輝;沈紅霞;彭福祥;宋娜;耿妙苗
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及應用于小麥成熟胚培養的干胚游離方法。

背景技術

小麥是我國的重要糧食作物，與國家糧食安全、國民經濟發展、社會穩定和人民生活水平的提高有著密切的關系。近年來，農業生物技術的飛速發展為小麥遺傳育種研究提供了新的動力，其中小麥轉基因技術為開展小麥的基因組研究和遺傳改良開辟了廣闊的前景。

小麥轉基因技術的最重要的基礎是小麥組培體系的建立及完善。小麥組培體系的外植體源主要有幼胚、花藥、頂端分生組織、幼穗、成熟胚等，其中小麥幼胚的愈傷組織誘導和再生能力較高，是目前公認的最好的外植體源之一。幼胚的獲取有一個嚴重的局限性，即受小麥生長季節及環境條件的影響，這給小麥遺傳轉化研究帶來了眾多不便。為了有效地克服以上不足，以小麥成熟胚作為組織培養的外植體越來越受到廣大研究者的歡迎，小麥成熟胚還具有取材方便、保存期長、個體間生理狀況相似，可大量獲得等優點，更加有利于小麥轉基因研究的進行。

采用成熟胚進行轉基因操作，最初采用剝取完整胚直接接種的方法，其再生效果很差、再生率較低、大多數基因型不能得到再生植株。后來逐步研究并發現了胚乳支撐接種法、成熟胚切割接種法以及成熟胚刮碎接種法（刮胚法）等，胚性愈傷形成率及再生頻率得到了一定的提高。其中刮胚法的再生效果最好，是目前公認的常規方法。以上前人的接種方法均是對在種子進行消毒后，在超凈臺一粒粒的對浸泡過夜種子的胚進行剝取并接種，其操作繁瑣，容易污染，耗費時間及勞動力。

發明內容

本發明的目的是提供用于一種應用于小麥成熟胚培養的干胚游離方法。

本發明提供了一種禾本科植物取胚方法，包括如下步驟：將禾本科植物的籽粒(未經浸泡處理的籽粒，或稱干燥的籽粒)打碎(打碎程度以大多數顆粒的粒度介于9目篩和30目篩之間為準)，先過9目網篩去除大顆粒，再過30目網篩去除小顆粒，從粒度介于9目篩和30目篩之間的顆粒中挑取1-2mm的胚組織（淡黃色，形狀似月牙，約占破碎組織的40%左右）。

所述禾本科植物具體可為小麥，如小麥品種“遼春18號”。

本發明還保護所述方法在制備禾本科植物的愈傷組織中的應用。

本發明還保護一種制備禾本科植物的愈傷組織的方法，包括如下步驟：

（1）將禾本科植物的籽粒(未經浸泡處理的籽粒，或稱干燥的籽粒)打碎(打碎程度以大多數顆粒的粒度介于9目篩和30目篩之間為準)，先過9目網篩去除大顆粒，再過30目網篩去除小顆粒，從粒度介于9目篩和30目篩之間的顆粒中挑取胚組織（淡黃色，形狀似月牙，大小為1-2mm，約占破碎組織的40%左右）；

（2）將步驟（1）得到的胚組織用水洗滌，然后用2.5g/100ml次氯酸鈉水溶液消毒1分鐘，然后用水洗滌；

（3）將權利要求（2）得到的胚組織接種至誘導培養基并進行暗培養，得到愈傷組織。

所述禾本科植物具體可為小麥，如小麥品種“遼春18號”。

本發明還保護所述方法在禾本科植物的遺傳轉化中的應用。

本發明還保護一種制備轉基因禾本科植物的方法，包括如下步驟：

（1）將禾本科植物的籽粒(未經浸泡處理的籽粒，或稱干燥的籽粒)打碎(打碎程度以大多數顆粒的粒度介于9目篩和30目篩之間為準)，先過9目網篩去除大顆粒，再過30目網篩去除小顆粒，從粒度介于9目篩和30目篩之間的顆粒中挑取胚組織（淡黃色，形狀似月牙，大小為1-2mm，約占破碎組織的40%左右）；

（2）將步驟（1）得到的胚組織用水洗滌，然后用2.5g/100ml次氯酸鈉水溶液消毒1分鐘，然后用水洗滌；

（3）將權利要求（2）得到的胚組織進行愈傷誘導培養（具體可在誘導培養基中25℃暗培養1周），得到愈傷組織；

（4）將步驟（3）得到的愈傷組織進行高滲培養（具體可在高滲培養基中25℃暗培養4-6小時），然后用基因槍轟擊攜帶目的基因的重組表達載體，然后進行恢復培養（具體可在恢復培養基中25℃暗培養1周）；

（5）取完成步驟（4）的愈傷組織，采用0.75mg/L草甘膦進行篩選培養（具體可在含0.75mg/L草甘膦的篩選基礎培養基中，25℃、光照12小時/黑暗12小時的條件下培養1周），然后在0.75mg/L草甘膦濃度下進行分化培養（具體可在含0.75mg/L草甘膦的分化基礎培養基中，25℃、光照12小時/黑暗12小時的條件下培養一個月）；