[發明專利]一種西蘭花離體細胞快速增殖方法

有效

• 申請號: 201310363935.1
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103416309A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 李勝;張品南;周文政;馬紹英;唐斌;劉會杰;趙生琴;時振振;蘇李維
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學;蘭州匯通生物科技有限公司;甘肅順意生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

技術領域

本發明涉及植物生物技術領域，尤其涉及一種西蘭花離體細胞快速增殖方法。

背景技術

西蘭花（Brassica?oleracea?L.?var?italica?Plenck）屬十字花科蕓墓屬甘藍種，為一、二年生草本植物。西蘭花以頑強的生命力、不可替代的營養價值、藥用價值、超乎食用價值被譽為“防癌、抗癌新秀”風靡世界。日本的農業研究院表示異硫代氰酸鹽能阻止黑色素癌細胞的生長。其中，蘿卜硫素是迄今為止蔬菜中發現的抗癌活力最強的一類異硫代氰酸鹽，它的抗癌作用已在大鼠的乳腺癌、皮膚中得到充分的證明。近年來，從西蘭花種子、不同器官中提取蘿卜硫素的研究較廣，但是從這些材料中提取蘿卜硫素只能依賴于植物本身，嚴重受到成本高、含量低、季節、植物生長周期、土地資源等多因素的限制。解決這一問題的根本方法在于創造出一種西蘭花離體細胞快速增殖方法。

然而，想達到快速增殖的目的，必須考慮西蘭花品種、培養基、培養條件以及生長周期等內外因素，其中誘導和增殖培養基及其激素濃度配比的選擇起著決定性作用，以至于對西蘭花器官材料進行離體細胞誘導和快速增殖條件進行優化，找到最佳的誘導與增殖的培養環境，完成西蘭花細胞的快速大量增殖方法的優化是非常必要的。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種有效快捷的西蘭花離體細胞快速增殖方法。

為解決上述問題，本發明所述的一種西蘭花離體細胞快速增殖方法，包括以下步驟：

⑴制備MS基本培養基：

首先在1000mL的燒杯中，將4.5?g~5.5g的瓊脂加入溫度為85~95℃的蒸餾水中，充分攪拌至所述瓊脂至完全溶解，得到瓊脂水溶液；然后在所述瓊脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、鐵鹽母液20mL、鈣鹽母液20mL、鎂鹽母液20mL、有機母液20mL、肌醇母液20mL，充分攪拌后加入30g的蔗糖，攪拌至蔗糖完全溶解后用蒸餾水定容至1000mL刻度處，攪勻后，加入濃度為0.1mol/L?NaOH或濃度為0.1mol/L?HCl調節pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分裝為一瓶，經121℃滅菌20min后室溫下水平靜置冷卻4h，即得MS基本培養基；

⑵西蘭花離體細胞獲得及接種方法：

將當年西蘭花種子用清水沖洗20~40min后，先用質量濃度為75%的酒精消毒0.25~0.75min，再用質量濃度為1%?NaClO消毒2~6min，得到無菌種子；所述無菌種子用無菌水涮洗4~5次并接種于所述MS基本培養基上，在光照強度為4000~6000LX、溫度為24~26℃條件下培養14d后得到無菌苗，其中每40~60mL所述MS基本培養基中接種5~8顆種子；切取長度為5mm的胚芽并以正面朝上接種到MS誘導培養基上，其中每40~60mL所述MS誘導培養基中接種4~6個胚芽，于黑暗、溫度為24~26℃條件下脫分化培養30d即得西蘭花離體細胞；

⑶西蘭花離體細胞增殖方法：

將所述西蘭花離體細胞接種于MS增殖培養基上，于黑暗、溫度為24~26℃條件下培養15~20d即可，其中每40~60mL所述MS增殖培養基中接種4~6塊且每塊0.05~0.1g的所述西蘭花離體細胞。

所述步驟⑵中的MS誘導培養基是指首先在1000mL的燒杯中，將4.5?g~5.5g的瓊脂加入溫度為85~95℃的蒸餾水中，充分攪拌至所述瓊脂至完全溶解，得到瓊脂水溶液；然后在所述瓊脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、鐵鹽母液20mL、鈣鹽母液20mL、鎂鹽母液20mL、有機母液20mL、肌醇母液20mL，充分攪拌后加入30g的蔗糖，攪拌至蔗糖完全溶解，得MS基本培養基混合液；其次在所述MS基本培養基混合液添加2.0mg的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）與1.0mg的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D），后用蒸餾水定容至1000mL刻度處，攪勻后，加入濃度為0.1mol/L?NaOH或濃度為0.1mol/L?HCl調節pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分裝為一瓶，經121℃滅菌20min后室溫下水平靜置冷卻4h即得。