[發明專利]一種西蘭花離體細胞快速增殖方法

有效

• 申請號: 201310363935.1
• 申請日: 2013-08-20
• 公開（公告）號: CN103416309A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 李勝;張品南;周文政;馬紹英;唐斌;劉會杰;趙生琴;時振振;蘇李維
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學;蘭州匯通生物科技有限公司;甘肅順意生物科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

1.一種西蘭花離體細胞快速增殖方法，包括以下步驟：

⑴制備MS基本培養基：

首先在1000mL的燒杯中，將4.5?g~5.5g的瓊脂加入溫度為85~95℃的蒸餾水中，充分攪拌至所述瓊脂至完全溶解，得到瓊脂水溶液；然后在所述瓊脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、鐵鹽母液20mL、鈣鹽母液20mL、鎂鹽母液20mL、有機母液20mL、肌醇母液20mL，充分攪拌后加入30g的蔗糖，攪拌至蔗糖完全溶解后用蒸餾水定容至1000mL刻度處，攪勻后，加入濃度為0.1mol/L?NaOH或濃度為0.1mol/L?HCl調節pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分裝為一瓶，經121℃滅菌20min后室溫下水平靜置冷卻4h，即得MS基本培養基；

⑵西蘭花離體細胞獲得及接種方法：

將當年西蘭花種子用清水沖洗20~40min后，先用質量濃度為75%的酒精消毒0.25~0.75min，再用質量濃度為1%?NaClO消毒2~6min，得到無菌種子；所述無菌種子用無菌水涮洗4~5次并接種于所述MS基本培養基上，在光照強度為4000~6000LX、溫度為24~26℃條件下培養14d后得到無菌苗，其中每40~60mL所述MS基本培養基中接種5~8顆種子；切取長度為5mm的胚芽并以正面朝上接種到MS誘導培養基上，其中每40~60mL所述MS誘導培養基中接種4~6個胚芽，于黑暗、溫度為24~26℃條件下脫分化培養30d即得西蘭花離體細胞；

⑶西蘭花離體細胞增殖方法：

將所述西蘭花離體細胞接種于MS增殖培養基上，于黑暗、溫度為24~26℃條件下培養15~20d即可，其中每40~60mL所述MS增殖培養基中接種4~6塊且每塊0.05~0.1g的所述西蘭花離體細胞。

2.如權利要求1所述的一種西蘭花離體細胞快速增殖方法，其特征在于：所述步驟⑵中的MS誘導培養基是指首先在1000mL的燒杯中，將4.5?g~5.5g的瓊脂加入溫度為85~95℃的蒸餾水中，充分攪拌至所述瓊脂至完全溶解，得到瓊脂水溶液；然后在所述瓊脂水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、鐵鹽母液20mL、鈣鹽母液20mL、鎂鹽母液20mL、有機母液20mL、肌醇母液20mL，充分攪拌后加入30g的蔗糖，攪拌至蔗糖完全溶解，得MS基本培養基混合液；其次在所述MS基本培養基混合液添加2.0mg的6-芐氨基腺嘌呤與1.0mg的2,4-二氯苯氧乙酸，后用蒸餾水定容至1000mL刻度處，攪勻后，加入濃度為0.1mol/L?NaOH或濃度為0.1mol/L?HCl調節pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分裝為一瓶，經121℃滅菌20min后室溫下水平靜置冷卻4h即得。

3.如權利要求1所述的一種西蘭花離體細胞快速增殖方法，其特征在于：所述步驟⑶中的MS增殖培養基是指首先在1000mL的燒杯中，將4.5?g~5.5g的瓊脂和200mg水解酪蛋白分別加入溫度為85~95℃的蒸餾水中，充分攪拌至所述瓊脂和所述水解酪蛋白至完全溶解，得到瓊脂蛋白水溶液；然后在所述瓊脂蛋白水溶液中依次加入大量元素母液20mL、微量元素母液20mL、鐵鹽母液20mL、鈣鹽母液20mL、鎂鹽母液20mL、有機母液20mL、肌醇母液20mL，充分攪拌后加入30g蔗糖，攪拌至蔗糖完全溶解，得MS基本培養基混合液；其次在所述MS基本培養基混合液添加1.7mg的6-芐氨基腺嘌呤與0.9mg的萘乙酸，后用蒸餾水定容至1000mL刻度處，攪勻后，加入濃度為0.1mol/L?NaOH或濃度為0.1mol/L?HCl調節pH值至5.8~6.0；最后在100mL三角瓶中每40~60mL分裝為一瓶，經121℃滅菌20min后室溫下水平靜置冷卻4h即得。

4.如權利要求1、2或4所述的一種西蘭花離體細胞快速增殖方法，其特征在于：所述大量元素母液是指含有硝酸銨82500mg/L，硝酸鉀95000mg/L，磷酸二氫鉀8500mg/L的混合液。