[發(fā)明專利]基因組減少的細(xì)菌

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310363511.5
• 申請(qǐng)日: 2003-01-22
• 公開（公告）號(hào): CN103540543A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: F·R·布拉特納;G·波斯發(fā);C·D·赫林;G·普倫基特;J·D·格蘭斯納;T·M·托斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 威斯康星校友研究基金會(huì)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N15/09;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;盧蓓

本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?38025450的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)PCT/US2003/001800的中國(guó)國(guó)家階段申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本專利申請(qǐng)是提交于2002年1月23日的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)10/057,582和提交于2002年9月6日的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)60/409,080的后繼部分，它們都全部納入本文供參考。

關(guān)于聯(lián)邦贊助研究或發(fā)展的聲明

本發(fā)明得到美國(guó)政府支持進(jìn)行，由下列機(jī)構(gòu)授予：NIH?GM35682。美國(guó)對(duì)此發(fā)明有一些權(quán)利。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因組減少的細(xì)菌。

背景技術(shù)

細(xì)菌用于生成廣泛范圍的商業(yè)產(chǎn)品。例如，許多鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株和桿菌屬(Bacillus)菌株用于生成抗生素；脫氮假單胞菌(Pseudomonas?denitrificans)和許多丙酸菌屬菌株用于生成維生素B12；一些其它細(xì)菌用于生成維生素核黃素；黃色短桿菌(Brevibacterium?flavum)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium?glutamicum)分別用于生成賴氨酸和谷氨酸作為食物添加劑；其它細(xì)菌用于生成其它氨基酸作為食物添加劑；真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes?eutrophas)用于生成可生物降解的微生物塑料；許多醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡萄糖酸菌(Gluconobacter)菌株用于生成醋。近來，細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)更常被遺傳改造和用作宿主細(xì)胞以在實(shí)驗(yàn)室以及工業(yè)設(shè)置中生成生物制劑，如蛋白質(zhì)和核酸。制藥業(yè)支持了一些成功產(chǎn)品的例子，它們是在發(fā)酵罐中培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的人類蛋白質(zhì)。

正常細(xì)菌蛋白質(zhì)不利影響所需蛋白產(chǎn)物從工程菌中生成或純化不是不普遍。例如，當(dāng)大腸桿菌用作宿主細(xì)胞以產(chǎn)生大量基因編碼的所需產(chǎn)物，基因通過質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞，一些正常大腸桿菌基因產(chǎn)物可干擾質(zhì)粒DNA的導(dǎo)入和維持。更重要的是，由于細(xì)菌產(chǎn)生蛋白質(zhì)中的細(xì)菌培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)，通常純化重組蛋白的成本可大于生成成本，細(xì)菌宿主生成的一些天然蛋白質(zhì)對(duì)于純化問題敏感。此外，許多細(xì)菌菌株產(chǎn)生的毒素必須從正生成的靶蛋白中純化出且一些菌株能同時(shí)產(chǎn)生大小與靶蛋白接近的天然蛋白質(zhì)，從而使大小分離不能用于純化過程。

然而同樣，發(fā)酵罐中用于生成重組蛋白的細(xì)菌基因組包括許多不必需基因。在自然環(huán)境中生長(zhǎng)的細(xì)菌有許多條件響應(yīng)基因以提供機(jī)制在溫度、壓力或缺乏食物來源的困難環(huán)境條件中生存。發(fā)酵罐中生長(zhǎng)的細(xì)菌沒有這些問題并因而不需要這些條件響應(yīng)基因。細(xì)菌宿主將各增殖循環(huán)的代謝能量用于復(fù)制這些基因。因此，用于生成重組蛋白的細(xì)菌宿主所產(chǎn)生的不必需基因和不需要蛋白導(dǎo)致系統(tǒng)缺乏效率，這可被改進(jìn)。

使微生物基因組產(chǎn)生缺失不是很困難。可簡(jiǎn)單通過缺失基因組區(qū)域在生物體中進(jìn)行隨機(jī)缺失研究以確定生物體的什么特性由于缺失基因而失去。然而，基因組DNA特定區(qū)域進(jìn)行靶缺失更困難，如果發(fā)明目標(biāo)之一是缺失后不在生物體留下插入DNA更加困難，這里插入DNA定義為“瘢痕”。如果插入DNA即瘢痕區(qū)域在基因組缺失過程后留下，這些區(qū)域可作為不需要重組的位置，能切除所需或產(chǎn)生基因組重排的基因組區(qū)域。在確立一系列多種缺失時(shí)，前面步驟留下的瘢痕可作為隨后缺失步驟的人工靶。當(dāng)方法重復(fù)用于從基因組產(chǎn)生一系列缺失時(shí)更是如此。換句話說，如果留下插入DNA，生物體由于缺失過程變成遺傳不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供方法用于優(yōu)選減少生物體基因組而不在基因組中留下瘢痕。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種細(xì)菌，所具有的基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少百分之二(2％)到百分之二十(20％)。基因組優(yōu)選比其天然親代基因組小至少百分之七(7％)。基因組更優(yōu)選比其天然親代菌株基因組小至少百分之十四(14％)到百分之二十(20％)。當(dāng)用于生成產(chǎn)品時(shí)，具較小基因組的細(xì)菌可有一個(gè)或多個(gè)下列優(yōu)勢(shì)。第一，生產(chǎn)過程在資源消耗或生產(chǎn)速度、最終產(chǎn)生百分比或所有三個(gè)方面效率更高。第二，可簡(jiǎn)化產(chǎn)品純化過程或能產(chǎn)生更純的產(chǎn)物。第三，以前由于天然蛋白質(zhì)干擾不能生成的產(chǎn)品可被制成。第四，所需產(chǎn)品的每細(xì)胞產(chǎn)量可增加。