[發明專利]基因組減少的細菌

有效

• 申請號: 201310363511.5
• 申請日: 2003-01-22
• 公開（公告）號: CN103540543A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: F·R·布拉特納;G·波斯發;C·D·赫林;G·普倫基特;J·D·格蘭斯納;T·M·托斯
• 申請（專利權）人: 威斯康星校友研究基金會
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;盧蓓

1.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因組被遺傳改造成比其天然親代大腸桿菌菌株基因組小5％至40％，其中從所述細菌基因組缺失的序列不會不利地影響細菌在特定生長條件下生存和增殖的速度，其中大腸桿菌基因組被遺傳改造以從大腸桿菌基因組中缺失一個或更多個DNA，該DNA選自天然親代菌株基因組中的鞭毛基因、限制性修飾系統基因、脂多糖表面基因、插入序列、rhs元件、毒素基因、致病基因、菌毛基因、侵襲素基因、周質蛋白基因、膜蛋白基因、原噬菌體、假基因、K島、噬菌體受體、非轉錄區以及不在任意兩個大腸桿菌菌株中都存在的基因或其它DNA序列，

其中所述大腸桿菌的基因組缺失了以下基因或其直系同源物中的一個或更多個：

b0247-b0310(MD1)，b1337-b1411(MD2)，b2442-b2450(MD3)，b2622-b2660(MD4)，b1994-b2008(MD5)，b3323-b3338(MD6)，b2349-b2363(MD7)，b1540-b1579(MD8)，b4271-b4320(MD9)，b2969-b2987(MD10)，b1138-b1172(MD11)，b0538-b0565(MD12)，b0016-b0022(GP1)，b0577-b0582(GP2)，b2389-b2395(GP3)，b0358-b0368(GP4)，b0370-b0380(GP5)，b2856-b2863(GP6)，b3042-b3048(GP7)，b0656(GP8)，b1325-b1333(GP9)，b2030-b2062(GP10)，b2190-b2192(GP11)，b3215-b3219(GP12)，b3504-b3505(GP13)，b1070-b1083(GP14)，b1878-b1894(GP15)，b1917-b1950(GP16)，b4325-b4358(GP17)，b0497-b0502(GP18)，b0700-b0706(GP19)，b1456-b1462(GP20)，b3482-b3484(GP21)，b3593-b3596(GP22)，b0981-b0988(GP23)，b1021-b1031(GP24)，b2080-b2096(GP25)，b3441-b3446(GP26)，b3557-b3558(GP27)，and?b0150-b0153(MD40)。

2.如權利要求1所述的大腸桿菌，其基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小5％至20％。

3.如權利要求1或2所述的大腸桿菌，其基因組被遺傳改造成小于4.27Mb。

4.如權利要求1-3中任一項所述的大腸桿菌，其基因組被遺傳改造成小于4.00Mb。

5.如權利要求1所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌基因組中一個或多個編碼蛋白質的基因被缺失，所述蛋白分泌到其周質或在周質中加工，所述一個或多個基因選自fliY、yedO、nfnB、tauA、mppA、tynA、chiA、fimC、fecB、ygiH、yagP和yhcA。

6.如前述權利要求1-5中任一項所述的大腸桿菌，當與其天然親代相比時，缺乏21.5％的蛋白質編碼基因。

7.一種通過在細菌基因組中己知序列的所選基因組區域產生缺失而不引入瘢痕來產生權利要求1至6中任一項所述細菌的方法，所述方法包括步驟：

產生人工DNA序列，所述人工DNA序列包括：一端是與待缺失基因組區域左側翼基因組序列相同的1號序列，接著是與待缺失基因組區域右側翼基因組序列相同的2號序列；另一端是與待缺失基因組區域中基因組序列相同的3號序列；以及線性DNA分子一端的2號序列與線性DNA分子另一端的3號序列之間的序列特異性核酸酶識別位點，其中所述識別位點不存在于細菌基因組中；

在有利于第一和第三序列與細菌基因組中序列同源重組的條件下將人工DNA序列導入細菌；

將表達載體導入細菌，所述細菌基因組包含插入正確位置的線性DNA分子，該表達載體用于表達識別識別位點的序列特異性核酸酶；

在細菌中表達所述序列特異性核酸酶；以及

收集在該序列特異性核酸酶表達時存活且包含正確缺失的細菌，和任選地重復上述步驟直至獲得其基因組具有至少5％缺失的細菌。